黄土露天矿区不同复垦年限重构土壤微生物数量差异及其影响因素分析

1、黄土露天矿区不同复垦年限重构土壤微生物数量差异及其影响因素分析摘要：研究目的：研究不同复垦年限重构土壤中微生物数量差异及其影响因素，为露天煤矿的土地复垦和生态恢复 及管理提供一定的理论依据和指导。研究方法：野外调查与采样、时空替代、单因素方差分析以及冗余分析。研究 结果：(1)0-10 cm土层，复垦27年的样地R-27a土壤细菌、真菌和放线菌数量分别达到原地貌3类土壤微生物数量 的68.23%、68.81%和70.08%； 10-20 cm土层，样地R-27a的3类土壤微生物分别达到原地貌3类土壤微生物数量的 70.41%、70.94%和72.07%。不同复垦年限重构土壤0- 10 cm和1

2、0- 20 cm土层的3类土壤微生物数量与原地貌小叶杨 林地仍存在显著性差异。(2)通过冗余分析对0 -10 cm和10- 20 cm土层土壤微生物影响因素分析可得，不同复垦年 限样地的重构土壤微生物的受到土壤理化性质影响极大，对0- 10 cm和10- 20 cm表层重构土壤微生物数量影响最大 的土壤物理性质是土壤容重和土壤砾石含量；对表层重构土壤微生物数量影响最大的土壤化学性质是土壤有机质和 土壤速效钾。研究结论：从土壤微生物数量的视角来研究矿区重构土壤生态系统的恢复状况，可为矿区生态系统功能 恢复提供实践支撑。关键词：土地复垦；重构土壤；土壤理化性质；土壤微生物；冗余分析1引言煤炭开采为

3、社会经济发展提供了保障，但破坏了 区域内的生态环境，造成土壤损毁、植被破坏等生态 退化问题的产生1o 土壤微生物是复杂的土壤生态系 统极其重要的组成成分之一,是全球生物地球化学 循环的重要驱动因子3-4，且土壤中微生物的种类繁 多，数量巨大，活动强度大，是土壤系统中各种生物 化学进程的主要推动者5，对维持生态系统功能和服 务起着重要作用闵。土壤微生物群落结构特征对于土 壤环境的变化也十分敏感，能够提前反映土壤理化性 质的变化,是土壤质量评价的重要因子6-8o目前，土 壤微生物数量作为反映土壤质量变化敏感因子和表 征土壤生态系统稳定性的重要参数已经受到了国内 外研究学者的广泛重视9-11，利用土

4、壤微生物数量等 早期预警的生态指标对矿区重构土壤质量变化及其 驱动因子探究已有报道，但土壤微生物群落的产生和 维持机制尚不完全清楚12-15，土壤微生物等相关指标 也未得到相应的重视与关注。已有的相关研究采用 单因素方差分析、相关性分析、多元线性回归、主成 分分析及高通量测序工具等研究方法，从不同土壤深 度、不同植被覆盖类型的角度开展了土壤理化性质、植 被覆盖等因素对土壤微生物的影响研究，揭示了土壤理 化性质的变化状况及影响微生物的主要驱动因素16-22o 其次，国土空间生态修复强调“整体保护、系统修复和 综合治理”四，但目前针对矿区生物多样性等的研究 多集中于地表动植物24，对已复垦区域的地

5、下土壤生 态系统的评价和监测研究较为薄弱，土地复垦监测的 指标也鲜有涉及土壤微生物等指标，开展土壤微生物 的相关理论基础研究能够为制定更加全面科学的土 地复垦监测指标提供一定的借鉴意义，也是实现矿区 土地复垦生态、经济和社会效益的协调统一的重要基 础四。土壤作为生态系统能够维持和发挥相应功能 的重要载体，利用土壤微生物数量的变化状况在一定 程度上能够从生态学的角度反映矿区重建生态系统 的变化过程，尝试开展矿区复垦地表层土壤微生物 的时空动态变化及其关键影响因素的研究，能够为促 进复垦地重构土壤质量提升提供一定的理论依据。 综上，针对矿区重构土壤微生物数量特征及其影响因 素的研究相对不足，导致对

6、矿区重构土壤生态恢复的 认识不够全面，研究不同复垦年限土壤理化性质对微 生物数量的影响有助于深入了解重构土壤微生物的 变化和响应机制，对增强和提高矿区重构生态系统的 长期稳定性具有重要意义。本文以中煤平朔矿区已复垦的排土场为研究对 象,采用野外调查与采样、时空替代、单因素方差分析 以及冗余分析的方法，分析土壤微生物数量与所选土 壤理化性质之间的关系，厘清矿区复垦地表层重构土 壤理化性质和土壤微生物数量的差异及其变化的影 响因素，以期为构建土壤质量和土壤微生物等生态监 测指标提供理论基础，同时为矿区生态系统功能恢复 提供实践支撑。2材料与方法2.1研究区概况中煤平朔矿区地处黄土高原晋陕蒙接壤的黑

7、三 角地带，属山西省朔州市,煤炭储量丰富27，矿区开采 导致土地利用景观格局朝着复杂化和多样化发展。 平朔矿区属温带半干旱大陆性季风气候，土壤侵蚀 严重，降水较少且时间上分布不均，是典型的生态脆 弱区29。土壤类型主要为黄绵土和栗钙土，土壤pH 呈碱性。平朔露天煤矿的开采造成了区域内严重的 土壤损毁等生态环境恶化问题，矿区采取“开采一排 弃一复垦”一条龙的作业技术来实现矿区边开发边 保护的发展模式。本文选取7个不同复垦年限的排 土场为研究对象（图1）,东露天排土场是排土完毕未 进行复垦的样地，南排、西排、安家岭、西排扩大区、 南寺沟和内排为已复垦地，分别于1992年、1994年、 2003年、

8、2004年、2012年和2013年开展了土地复垦 与生态重建。图1研究样地分布图Fig.1 Distribution of the study samples2.2 土壤样品采集通过中煤平朔矿区实地调查并向专家咨询了解 排土场复垦年限，采用时空替代法，2019年7月在平 朔矿区的东露天、内排、南寺沟、西扩、安家岭、西排、 南排的7个排土场和非矿区北部的原地貌小叶杨林地 布设样地并采集土壤剖面，且各样地复垦后土壤本身 没有受到扰动影响。设置乔木样方10 mx10 m,草本 样方1 mx1 m,每个样地挖取3个土壤剖面，采样深 度为60 cm,每10 cm分层采集土壤样品。此次研究共 选择了 8个

9、样地、24个剖面0 10 cm、1020 cm的土 壤样品,采集样品完毕后带回实验室并进行土壤理化 性质和土壤微生物数量及酶活性的测定。样地R-6a、 R-7a、R-15a、R-16a、R-25a、R-27a、OL和 R-0a 分别 对应复垦时间6年、7年、15年、16年、25年、27年以及 原地貌和未复垦地（表1）,对应图1中的S3、S6、S1、 S5、S2、S4、S8 和S7。2.3采集样品测定2.3.1 土壤理化性质测定土壤容重用环刀法测定,土壤田间持水量利用烘 干法进行测定，土壤质地采用简易比重计法测定,土 壤pH值通过测定仪测定，土壤有机质采用高锰酸钾 氧化法测定，土壤全氮采用凯氏法

10、测定，土壤有效氮 采用碱解法测定,土壤有效磷采用碳酸氰钠浸提-钼 锑抗比色法测定，土壤速效钾采用醋酸铵浸提-原子 吸收光谱法测定。表1 土壤剖面采集样地基本信息表Tab.1 Basic information of soil profile collection site编号剖面编号样地位置植被配置状况复垦年限/年S7-1东露天外排土场排土完R-0aS7-2毕未复垦0S7-3S3-1内排刺槐、小叶杨、卫R-6aS3-2矛、苜蓿等6S3-3S6-1R-7aS6-2南寺沟小叶杨7S6-3S1-1西排扩大苜蓿R-15aS1-2区15S1-3S5-1R-16aS5-2安家岭荒草16S5-3S2-1西排

11、刺槐、青杆、白杆、R-25aS2-2油松、旱柳、榆树25S2-3S4-1南排刺槐、榆树、油松R-27aS4-2等27S4-3S8-1矿区未采OLS8-2区小叶杨原地貌S8-32.3.2 土壤微生物数量及酶活性测定土壤微生物主要类群数量的测定采用稀释涂布平 板法测定。土壤细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，土壤 真菌采用孟加拉红培养基，土壤放线菌采用高氏一号 培养基。土壤蔗糖酶活性采用采用3-氨基_5-硝基水 杨酸比色法测定，土壤脲酶活性采用苯酚钠比色法测 定，土壤磷酸酶活性测定采用磷酸苯二钠方法,土壤样 品数据均由山西省生物研究院有限公司完成测定。2.4数据统计分析本文数据均使用Excel软件进行统计

12、整理，SPSS 25.0软件进行处理分析,Origin 2020进行图像绘制。 在SPSS中采用最小显著差数法进行单因素方差分析各 样地土壤微生物之间的显著性差异。利用Canoco 5.0 软件，通过RDA分析所选土壤理化性质指标和3类土 壤微生物数量之间的关系。对于冗余分析，使用蒙特 卡洛检验来检验微生物数量与每个土壤理化性质变 量之间的相关性，只有通过蒙特卡洛检验(P V 0.05) 才能保留排序图进行进一步分析。3结果与分析3.1不同复垦样地土壤理化性质的基本统计特征以不同复垦年限研究样地的土壤实测理化性质 数据为基础进行描述性统计分析，不同研究样地在经 过多年的土地复垦工作后，其土壤理

13、化性质均得到较 大改善，为土壤微生物的生存提供了良好环境。不同 复垦年限的研究样地010 cm和10 20 cm土层的土 壤理化性质基本统计特征如表2。最大值和最小值和 可以反映因子数值的变化范围，极差和标准差可以反 应各因子数据的离散程度。综合分析得，在0 10 cm 和1020 cm土层均表现为土壤田间持水量、土壤粘 粒含量、土壤砾石含量、土壤有机质、土壤有效氮和土 壤速效钾数值的极差明显较大,数据的离散程度相对 较大；土壤容重、土壤pH值和土壤有效磷的数值极差 较小，数据离散程度也相对较小;变异系数是衡量个 观测值变异程度的一个统计量，表2结果显示各样地 的010 cm和1020 cm

14、土层中，土壤容重和土壤pH 值为弱变异程度；土壤田间持水量、土壤粘粒含量、 土壤有机质、土壤有效氮、土壤有效磷和土壤速效钾 均为中等变异，土壤砾石含量和土壤全氮呈现强变异 性。综上所述并结合偏态系数分析发现，总体上研究 区内土壤各理化性质的变化和差异较大，其数值分布 多为离散型，即研究区内的经过不同年限的复垦，不 同样地之间的重构土壤理化性质存在较大差异性。3.2不同复垦年限微生物数量及酶活性的差异不同样地的细菌、真菌和放线菌数量差异性 分析如图2。在0 10 cm 土层，复垦时间为6年 的样地R-6a的土壤细菌、真菌和放线菌数量分别 达到 114.500 0 x 105 cfug-1、0.0

15、79 0 x 105 cfu-g-1 和 0.683 7x105 cfu-g-1，相较未复垦样地R-0a增幅分别 达118.65%、113.51%和102.46%,显著高于除原地貌 样地之外的其他复垦样地的3类微生物数量；样地 R-7a的3类微生物数量含量与样地R-27a的各类微 生物数量相当，与其余不同复垦年限的样地存在显 著差异性；而样地R-0a细菌、真菌和放线菌数量最 少,分别为52.366 7x 105 cfug-1、0.037 0 x 105 cfu-g-1 和 0.33 7 7x 105 cfu-g-1，显著低于其他研究样地的3类土 壤微生物数量；此外，各研究样地的3类土壤微生物

16、数量的均值由高到低依次为样地OL 样地R-6a 样表2研究样地的土壤理化性质描述性统计(N = 24)Tab.2 Descriptive statistics of soil physical and chemical properties of the sample plots (N=24)土层深度土壤性质最大值最小值极差平均值标准差变异系数偏态系数容重/(g*cm-3)1.721.200.521.440.139.090.12田间持水量/%16.875.1411.7211.953.2026.77-0.21pH值8.527.740.788.100.192.280.12砾石含量/(g/100 g

17、)16.070.0016.072.044.10201.542.29粘粒/%52.0510.5541.5027.6310.3037.260.340-10 cm全氮/%0.290.000.290.060.08120.272.33有机质/(gkg-1)20.661.7618.908.024.1852.071.07有效氮/(mgkg-1)84.096.8977.2032.4417.0652.581.07有效磷/(mgkg-1)5.110.514.602.041.0249.961.07速效钾Amg-kg-1)249.2033.41215.79125.9754.2843.090.41容重 Ag*cm-3)

18、1.681.300.381.500.095.970.09田间持水量/%14.997.087.9110.842.0518.930.24pH值8.487.890.598.170.151.870.24砾石含量(/ g/100 g)52.430.0052.434.1110.81262.804.00粘粒/%64.7812.0052.7829.4512.6442.911.1410 20 cm全氮/%0.100.000.090.020.02103.192.06有机质Ag,kg-)14.271.1813.104.473.3374.652.04有效氮/(mgkg-1)57.994.4953.5017.9213.

19、6275.972.04有效磷/(mgkg-1)3.560.043.191.170.8169.382.04速效钾/(mgkg-1)133.0517.30115.7581.3929.1335.790.50注：依据经典统计学对变异系数等级划分，当CV =10%,属于弱变异性；当10% CVv 100%,属于中等变异性；当CV100%，属于强变异性。偏态 系数的绝对数值越小，表示数据偏倚的程度越小；偏态系数的绝对数值越大，表示数据偏倚的程度越大。此处土壤砾石含量代表着每100 g土壤样品的砾 石含量；此处粘粒含量指50 g风干土壤样品中小于0.01 mm土粒的含量所占土壤样品的百分比。地R-7a 样地

20、R-27a 样地R-25a 样地R-16a样 地R-15a 样地R-0a,各个样地各类微生物数量之 间存在显著差异性状况；样地R-27a为复垦27年的 南排土场，复垦27年后土壤细菌、真菌和放线菌数 量分别达到 92.400 0 x105 cfug-1、0.064 1x105 cfu-g-1 和0.560 7x 105 cfu-g-1，相比未复垦样地R-0a的细 菌、真菌和放线菌数量分别增加了 76.45%、73.00%和 66.04%，分别达到原地貌3类土壤微生物的68.23%、 68.81%和70.08%，且仍显著低于原地貌3类土壤微 生物数量。在1020 cm 土层，各研究样地的3类 土

21、壤微生物数量的均值由高到低为样地0匕样 地 R-6a 样地 R-7a 样地 R-27a 样地 R-25a 样地R-16a样地R-15a样地R-0a，各个样地 各类微生物数量之间存在显著差异性状况；样地 R-6a的3类微生物数量显著高于其他复垦年限样 地的3类微生物数量，细菌、真菌和放线菌数量分别 达到 120.400 0 x105 cfug-1、0.083 0 x 105 cfu-g-1 和 0.716 7x105 cfu-g-1，相对于为复垦样地R-0a增幅分 别达 134.27%、125.66% 和 113.72%，样地 R-6a 是内排 土场，经过6年复垦后，复垦地重构土壤表层的3类 微

22、生物数量增加显著，但仍显著低于原地貌3类土壤 微生物数量。在1020 cm土层，样地R-27a的土壤 细菌、真菌和放线菌数量达到96.93 3 3x 105 cfu-g-1, 0.067 1x105 cfu-g-1 和0.585 7x105 cfu-g-1，分别达到 原地貌3类土壤微生物70.41%、70.94%和72.07%。复 垦27年后的样地R-27a的3类土壤微生物数量仍显著 低于原地貌的小叶杨林地。整体来看，在0 10 cm和 10-20 cm土层的3类微生物数量呈现随复垦时间的 变化趋势为先增长，后降低，而后又随着复垦年限的 增长不断增加的变化特点。不同研究样地之间的3类土壤酶活性

23、差异及变化 情况如图3所示。在0-10 cm和1020 cm土层中，蔗 糖酶、脲酶和磷酸酶活性均呈现随复垦时间的变化趋 势为先增长，随后逐渐降低，而后又随着复垦年限增 加而不断增长的变化特点。在0 10 cm土层,未受扰 动的原地貌小叶杨林的3类土壤酶活性最高，蔗糖酶、12O.10 O.00 O.02 O.8 6 4 o o O O.O.O.旧。胃100.0050.000.00| | 0 10 cm L_J 10 20 cmR-7a R-15a R-16a R-25a R-27aOL复垦样地图2不同样地0 10 cm和10 20 cm 土层的3类土壤微生物数量Fig.2 The number

24、of three types of soil microorganisms in different soil layers of 0 10 cm and 10 20 cm注：图中不同样地的土壤微生物数量为均值土标准差，柱状图上方不同字母表示不同样地之间差异性显著,PV0.05,下同。脲酶和磷酸酶活性分别达到0.970 0 mg - (1003.156 7 mg- (100 gh)-1 和0.720 0 mg( (100 g-h)-1； 其次是样地R-6a的3类土壤酶活性最高,蔗糖酶、脲 酶和磷酸酶活性分别达到1.056 7 mg( (100 gh)-1、 3.380 0 mg( (100 g

25、-h)-1 和0.770 0 mg( (100 g-h)-1,显 著高于除原地貌样地之外的其他复垦样地的3类酶 活性；样地R-0a的3类土壤酶活性均最小，且与样 地R-15a的3类土壤酶活性差异性均不显著,且显著 低于其他研究样地的3类土壤酶活性,其蔗糖酶，脲酶 和磷酸酶活性仅为0.810 0 mg-(100 gh)-1、2.740 0 mg- (100 g h)-1 和0.633 3 mg-(100 gh)-1。在 10-20 cm土 层中，不同研究样地之间各类土壤酶活性的差异性状 况与0 10 cm土层相同，仍是未经扰动的原地貌小叶 杨林的3类土壤酶活性最大,样地R-0a的3类土壤酶 活性

26、最低。3.3 土壤微生物与土壤理化性质的关系分析对7个不同数量复垦年限样地的土壤微生物数量 和土壤理化性质进行RDA冗余分析,得到010 cm和 10-20 cm土层的排序图(图4)。排序图中的排序轴 是参与分析的环境变量的多元多重回归组合,能够集 中体现解释变量对响应变量的影响。排序图中带有 箭头的线段，蓝色代表3类土壤微生物的数量、红色代 表各土壤理化性质指标；土壤理化性质线段长度代表 其对微生物影响程度的大小，线段越长其影响越大; 土壤理化性质线段和3类土壤微生物线段夹角的余弦 值在数值上等于相关系数,夹角越小,相关性越大。分析结果显示，在0 10 cm 土层，3类土壤微 生物数量分布在

27、第一轴和第二轴累计解释变量分 别达到66.34%和66.37%，且通过蒙特卡洛检验 (p = 0.038 V 0.05), 土壤微生物数量和土壤理化性质 冗余分析结果(图4(a)显示3类土壤微生物分布在 排序轴右侧,3类土壤微生物数量均与土壤理化性质 表现出一致的相关性规律，与土壤容重呈显著负相关 关系,与土壤田间持水量、土壤砾石含量和土壤全氮图3不同复垦年限样地0 10 cm和10 20 cm 土层的3类土壤酶活性Fig.3 Activity of soil enzymes in soil layers 0 10 cm and 10 20 cm in different years of r

28、eclamation(a) RDA1 (66.34%； p=0.0380.05)(b) RDA2 (86.47%(a) RDA1 (66.34%； p=0.0380.05)(b) RDA2 (86.47%； p=0.010.05)图4 0 10 cm和10 20 cm 土壤理化性质和土壤微生物数量的RDA排序图Fig.4 RDA sequence diagram of soil physical and chemical properties and soil microbial population in0 10 cm and 10 20 cm soils含量呈正相关关系,与土壤pH值、土壤

29、粘粒、土壤有 机质呈负相关关系,与土壤速效钾呈极显著正相关关 系；分析结果显示在010 cm 土层对3类微生物数量 影响较大的土壤理化性质是土壤容重、土壤粘粒、土 壤砾石含量以及土壤有机质和土壤速效钾。在1020 cm 土层，3类土壤微生物数量分布 在第一轴和第二轴的累计解释变量达到86.47%和 86.49%，并且通过蒙特卡洛检验(p = 0.01V 0.05),表 示3类土壤微生物数量与土壤理化性质存在显著相关 关系；3类土壤微生物数量和土壤理化性质冗余分析 结果(图4(b)显示，3类土壤微生物分布在排序轴的 右侧且3类土壤微生物与土壤理化性质的相关性规律 相一致；3类土壤微生物数量与土壤

30、容重呈极显著负 相关关系,与土壤田间持水量和土壤速效钾呈显著正 相关，与土壤粘粒、土壤pH值表现为负相关关系，和 土壤砾石含量、土壤全氮、土壤有机质均呈现正相关 关系；分析结果表明在1020 cm土层对3类微生物 数量影响较大的土壤理化性质是土壤容重、土壤砾石 含量、土壤全氮、土壤有机质和土壤速效钾。4讨论4.1 土壤理化性质对土壤微生物数量的影响本文研究结果表明，所有研究样地中细菌数量在 3类土壤微生物数量中最多，复垦地重构土壤的3类微 生物数量状况受到土壤pH的显著影响，而样地土壤 理化性质实测数据表明研究区域的土壤呈现碱性，细 菌和放线菌能够适应碱性的土壤条件,在一定程度上 造成了 3类

31、微生物数量的分布特征，这与王理德等30 的研究结果相同。从不同复垦年限的变化规律来看, 在010 cm和1020 cm 土层细菌、真菌和放线菌数 量随复垦时间的变化趋势为先增长后降低，而后又随 着复垦年限增长不断增加；此研究结果与于亚军15、 kumar17的研究结论存在一定的差异性,这是因为土 壤微生物与其所处土壤理化性质的变化密切相关，研 究区域和所选样地的差异，复垦后期管护措施不同和 矿区生态系统的复杂性都是造成研究结果存在差异的 重要原因。于亚军等15研究表明土壤理化性质随复 垦年限的增加有所改善,不同复垦年限样地的微生物 PLFAs浓度和酶活性也随复垦年限的增加均有不同程 度的增加，

32、土壤微生物群落对土壤性质变化具有指示 作用,能够作为煤矸山复垦土壤质量变化的微生物学 指标。KUMAR等17研究了印度地区不同恢复阶段煤 矸山的土壤理化性质和微生物特性的变化状况，认为 复垦年限是生态恢复过程中土壤理化性质和植被组成 变化的重要因素。土壤是土壤微生物生存和发挥相关 功能的重要载体31，本文研究表明,不同复垦年限样 地的表层土壤(0 20 cm)对土壤微生物数量影响最大 的土壤物理性质主要是土壤容重和土壤砾石含量；对 表层重构土壤微生物数量影响最大的化学性质主要 是土壤有机质和土壤速效钾；复垦样地土壤理化性质 对3类微生物的生存与功能发挥具有显著影响,这一结 论与 samaneh

33、16、sohini18、张小玲20、荀卫兵32等的 研究结果相符。荀卫兵等32研究结果显示经多年施 用不同肥料后，同种植被类型下的土壤pH值、土壤养 分含量、土壤微生物生物量、土壤微生物和微生物多 样性会产生显著性差异；而经过8个月的培养，灭菌 和接种土壤的微生物生物量与对照土壤相当，认为土 壤性质是影响土壤微生物区系的数量的决定性因素。 SAMANEH等16开展了伊朗北部森林生态系统中土壤 理化性质变量与土壤微生物之间的线性和非线性关 系的研究，分析表明土壤有机碳、土壤粒径分布、土壤 pH值、土壤电导率和土壤总氮均会对土壤微生物适宜 习性有显著影响。由此可见土壤理化性质对土壤微生 物的生存及

34、其功能的发挥具有极其重要的影响。4.2 土壤微生物数量研究对矿区土地复垦的启示煤炭开采为社会经济发展提供了保障，但破坏了 区域内的生态环境,造成土地损毁、土壤污染、植被破 坏等生态退化问题的产生1,在进行露天煤矿土地复 垦与生态重建时恢复地表植被和生物的同时也要重 视地下土壤微生物生态系统的构建，保障土壤微生物 的生存环境，进而使其发挥相应的功能来维持其所在 生态系统的稳定性。由于矿区重构土壤的特殊性，单 以土壤理化性质评价矿区已复垦排土场重构土壤质 量状况的敏感性不够；而短时间内复垦地的植被状况 受到了人为因素的严重影响33，难以准确反映复垦地 重构土壤质量及生态系统的恢复状况。土壤微生物 对土壤环境的变化极为敏感，能够及时地反映复垦地 重构土壤的恢复情况，是矿区土地复垦和生态恢复的 重要早期指标。目前已有相关研究通过引入微生物