广州大学小鼠离体细胞培养实验报告

1、. z.广 州 大 学综合设计性实验报告学 院 生 命 科 学 学 院 課 程 细 胞 生 物 学 实 验 实验工程 实验六 细胞培养 实验题目 小白鼠肝细胞的原代培养专 业 生物技术年级、班别 14级姓 名 陈子禧 学 号 1414300004 任课教师 陈 鲲完成日期 2016 年 5 月 23 日 摘要 目的掌握小鼠肝细胞、表皮细胞的体外培养方法。采用脱臼法处死小鼠，用植块培养法用眼科剪把肝组织剪成小于1mm大小的植块，接种于培养瓶中进展体外培养；并用单细胞培养法酶解法进展肝细胞以及表皮细胞的培养。通过光镜观察细胞形态结果成功地培养出肝细胞、表皮细胞。肝细胞植块组在体外培养一个星期仍能够

2、保持良好的生长状态。结论本实验成功地实现了肝细胞的体外培养方法，尤其在植块培养组中效果更为明显。关键词 原代培养 小白鼠 植块培养 酶解法 肝细胞 表皮细胞 目录1前言2实验原理3实验用品3.1试剂3.1.1 培养液 3.1.2 Hank液3.2 仪器3.3 材料 4 实验方法4.1前期消毒灭菌4.2 实验步骤5 实验结果 5.1.图片展示5.2.结果分析5.3结果汇总6 结果分析与讨论7 参考文献8 致谢1前 言目的 了解肝细胞、表皮细胞原代细胞培养的根本方法及操作过程。学习植块培养法、单细胞培养法酶解法、营养液的配制及酸碱度的调节。初步掌握无菌操作方法。意义：细胞培养是当前细胞生物学乃至整

3、个生命科学研究与生物工程中最根本的实验技术。当前，细胞培养技术广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，已开展成为一种重要的生物技术。1方法 ：采用肝组织块外植培养法通过无菌造作培养新生小鼠细胞。 结果 ：运用这种方法成功地培养出原代肝细胞 。结论 ：这种方法为广泛开展肝细胞原代培养奠定了根底。2实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织或器官，用植块培养法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。在准备过程中我们要是细

4、胞能在体外长期生长，必须满足两个根本要求：一.是供应细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二.严格控制无菌条件。3实验用品3.1器材眼科剪尖头、弯头各一把、眼科镊尖头一把、培养皿一个、试管一支、直、弯吸管各一支、刻度吸管一支、吸管胶头三个、小烧杯一个、培养瓶一个等。上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，9.910 4Pa 15磅灭菌30min，备用。此外，还有显微镜、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔、恒温箱。3.2试剂培养液 RPMI-1640 (2-3ml/培养瓶,根底培养基 80-90%

5、、胎牛血清 10-20%、双抗 1-2% ,主要提供生长因子和细胞因子。抗菌素：1万单位青、链霉素占1%。 组织清洗液hanks液、PBSPhosphate-Buffered Sallines3.3 材料小白鼠幼体2只4实验方法4.1前期准备工作4.1.1 对玻璃仪器进展清洗1浸泡：清水浸泡12小时2刷洗：清洁剂、毛刷刷洗，清洁剂清洗2次，自来水冲洗5次，烘箱50烘干 3然后再浸入 5 稀盐酸中 12 小时以除去脏物、铅、砷等物。4刷洗、烘干：12 小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。5泡酸、清洗：用清洁液重铬酸钾 120g ：浓硫酸 200ml ：蒸馏水 100

6、0ml 浸泡 12 小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗 15 次，最后蒸馏水冲洗 3-5 次和用双蒸水过 3 次。6烘干、包装：洗干净后先烘干，加脱脂棉，然后用纸包装。7 高压消毒：包装好的器皿装入高压锅灭菌8烘干：50烘箱进展烘干。对器械和无菌操作台进展消毒灭菌物理消毒灭菌法紫外线：进展30min照射，用于空气，操作台外表和不能使用其它法进展消毒的培养器皿；高压蒸气灭菌法：121，20min；干烤：160, 2 小时；化学消毒灭菌法75%酒精：主要用于操作者的皮肤，操作台外表及无菌室内的壁面处理；1%新洁尔灭：主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒；抗生素：用于培养液灭菌或预防培

7、养物污染，如青霉素、庆大霉素等。4.2 实验步骤6 细胞原代培养(1)用洗涤剂刷洗双手自来水冲净新洁尔灭浸泡进入无菌操作室。(2)操作前放入所需器具并进展30minUV灭菌，操作者于超净台内用酒精棉消毒双手切记：严禁将培养液含有血清、蛋白等在UV下进展灭菌。(3)翻开试管、吸管胶头包装，将试管插尽量斜插入试管架.(4)取出需用的吸管直、弯吸管各一支，刻度吸管一支套上胶头，将试管插入相应的试管中。(5)翻开培养皿以及解剖工具手持端的包装。(6)在小组其他成员已翻开腹腔的根底上切取小鼠肝脏组织块,并迅速取出肝脏并将其放入Hanks 液中进展漂洗2次.移入小烧杯中。并同时剪取表皮组织进展Hanks液

8、漂洗2次。注意:整个取材过程中,都要保持肝脏的湿润,随时给肝脏块滴加一些培养液或者平衡盐溶液，防止细胞脱水死亡 (7)接种与培养过程植块培养A 将拟培养的肝组织用眼科剪剪成约1mm大小的植块，用hanks液适当漂洗，弃hanks液，加少量培养液；将表皮组织稍微剪碎后放置胰蛋白酶中酶解3至5min，吸去上清液并立即参加培养液3至4ml，并轻柔吹打得上清液。B取2培养瓶，在培养瓶的上面做好标志在瓶侧注明班、组别、*、材料名称等信息。C 用培养液湿润的吸管小心吸取肝脏植块,轻轻吹出到培养瓶的培养瓶面内,按照一定的间隔和形式用弯吸管将植块排列好。D 翻转肝植块组培养瓶培养面在上方，参加4ml的培养液；

9、直接将表皮细胞组的上清液吸至培养瓶中。E 将培养皿加盖封口,送入37度恒温箱内,静置参加的培养液不浸泡植块，不从瓶口流出。F 假设干小时后长短视各人操作而异，待植块充分贴壁后，翻转培养瓶使植块浸于培养液中且不漂浮。G 观察 至于37度培养的细胞，需逐日进展观察，主要观察：1培养长与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。可能是瓶塞未盖紧或营养液pH过高。3培养液假设变为桔红色，一般表示细胞生长良好。 经过12天培养后，假设细胞生长情况较差或培养液变红了，则可换一次营养液。换液时也要注意无菌操作假设经过12天培养后,假设细胞生长情况较差或培养液变红,则需换液。酶解法与植块法有所区

10、别，植块组：从37摄氏度培养箱中取出培养瓶，于超净工作台内吸去全部旧培养液用平衡盐溶液轻缓漂洗培养物12次,弃平衡盐溶液，参加与换液前一样的量的培养液，放回原来的培养箱继续培养酶解法：将旧的培养液吸出约1/2再重新参加等量培养液。每日观察结果用文字记录，换液也需记录，在整个培养过程的不同阶段最少在前、中、后阶段置倒置显微镜下观察细胞生长情况并拍照记录。 *备注：每次取培养瓶时用酒精喷洒手掌及手臂，另外旋紧瓶口取出，再喷洒酒精，由于我们操作严谨，所以直至换液后正常生长期内未出现严重污染。中期换液一次5实验结果5.2.结果分析形态学观察结果4.11日别离的肝细胞，在培养3h后即能够充分贴壁生长并在

11、第三天已经开场观察到新生组织。用酶解法处理的表皮细胞，前期生长不够理想但到第10天开场观察到新生细胞。阶段一：肝细胞在生长期2448h，直至第三天4.13日，间隔接近48小时，细胞状态较好如图一所示，且生长的细胞越来越多，细胞开场在植块的边缘生长，形成一圈透明状的新生细胞；表皮细胞可能由于我们经历缺乏，酶解时间稍长，需要更多时间进展细胞分裂增殖，故第二天仅能观察到碎屑，如图二所示，但在第三天开场观察到局部细胞集团，未能肯定地确定是增殖细胞。如图三所示【此观察时期为第一周，第2-3天】阶段二：肝细胞生长第七天，已能在超过组织植块的*围下观察到单层生长的肝细胞，且较为明显(如图四所示)；另外表皮细

12、胞能观察到较多碎屑，且夹杂着局部圆形小型影像，推测可能为新生表皮细胞如图五所示【此观察时期为第一周，第7天】。阶段三：表皮细胞生长的第十一天图六，表皮细胞已经较为明显，尽管夹杂在细胞碎屑之中但明显能分辨出闪亮、形体较小、而且呈圆形的新生表皮细胞；肝细胞生长第十一天图七，图七植块周围有少量的细胞贴壁生长，其中有些透明状的是气泡,但明显观察到大量圆形闪亮黄色透明状细胞，中间带有细胞集团，但体积较小，推测可能为碎屑【此观察时期为第二周，第11天】阶段四：终止实验停顿培养，细胞生长第14天，肝脏植块组周围有雪花状微生物生长，另外表皮细胞组也已经无明显增殖细胞，较多不透光的细胞碎屑出现，故停顿实验如图八

13、所示。【此观察时期为第三周，第14天】5.3结果汇总：本次实验结果较为成功。肝细胞在培养第11天观察培养效果最正确，而表皮细胞同样在11天观察到增殖效果。但植块法在培养时长上比酶解法占优势，增殖速率较快且结果明显便于观察。其中我们实验共分为三个阶段阶段一：第一周，第2-3天其中进展过一次换液本阶段肝细胞已能观察到增殖效果，而表皮细胞仍然停留于原始状态。阶段二：第一周，第7天本阶段肝细胞的增殖效果已经十清楚显，能观察到单层的新生细胞。而表皮细胞的效果并不明显。阶段三：第二周，第十一天肝细胞以及表皮细胞的增殖效果都到达最正确，最易于观察。阶段四：肝细胞植块组已经出现微生物污染，表皮细胞有死亡迹象，

14、终止实验。5.1.图片展示图一:第三天48h小白鼠肝组织的生长情况图二:第二天小白鼠表皮细胞的生长情况图解： 图解比照第一天接入后观察的植块，植块边缘透光度提高第二天的效果与第一天移入细胞液的效果相似，在缩小放大倍数和增大光圈后可以观察得更为明显。 无明显细胞分裂增殖效果，移入培养箱继续观察。所以根本上可以确认有新生肝细胞生成。 拍摄时间：2016/4/1316:30)(拍摄时间：2016/4/12 10:50)图三：第三天小白鼠表皮细胞生长情况 图四：第七天小白鼠肝细胞生长情况图解： 图解：出现局部集团状的表皮细胞，如图D1、D2、D3区域。肝细胞已经较为明显，可以观察到白色圈包括着新生呈闪

15、亮状态的肝细胞。 拍摄时间：2016/4/13 (拍摄时间：2016/4.17)图五.第七天小白鼠表皮细胞生长情况 图六.第十一天小白鼠表皮细胞生长情况图解： 图解：较多碎屑夹杂着局部圆形小型影像，推测为新生表皮细胞 表皮细胞已经较为明显，尽管夹杂在细胞碎屑之中但明显能分辨出闪亮、形体较小、而且呈圆形的新生表皮细胞。拍摄时间：2016/4/17 (拍摄时间：2016/4/21)图七. 第十一天小白鼠肝细胞生长情况 图八.第十四天小白鼠表皮细胞生长情况金黄色透亮的圆形新生肝细胞，为总培养时期中最正确的状态 已经生成局部细胞废物，且含大量不透明死亡细胞碎屑。由此可以判断植块法培养肝脏细胞根本成功。

16、拍摄时间：2016/4/21(拍摄时间：2016/4/25)6 结果分析与讨论本实验用肝组织块外植培养法成功地培养出肝细胞，并利用单细胞培养法酶解法成功培养出表皮细胞。肝细胞植块培养法操作简单、肝组织易于贴壁、生长力好。这种方法也不需要摸索条件，容易成功且效率高易于观察。但通过本次实验我们探索到使用这种方法时要注意子组织块应尽量剪切均匀，约1mm左右。组织块过大，组织块中央的细胞不能得到充足的营养，不能完全游离出来。组织块相互距离以0.5cm为宜，在组织块植入的最初12天内，需保持绝对静置培养，以利于肝细胞贴壁，防止组织块漂浮。 而酶解法的技术含量和要求较高，尽管实验结果未如理想但仍为成功。酶解法要求酶解时间和取液量多少的把握程度较高，我们小组未有经历但经过学习和重复操作，通过学习，我们感觉在酶解法中取得的收益更多。细胞培养是现代生物科学中开展十分迅速的一种实验技术，它为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要奉献。细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，生长繁殖，并维持其构造和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。2所以我们通过本次实验过程能