微生物合成自养同化二氧化碳研究概述

1、微生物合成自养同化二氧化碳研究概述摘要微生物合成自养同化CO的研究旨在利用基因工程、代谢重组和定向进化等技术和方法，培育能够同化CO、实现完全 自养的工程菌，实现对CO的直接固定和利用。这方面的研究对于解决可持续性食品和燃料的生产以及CO排放引起的全球变 暖等重大问题具有极其重要的意义。本文概述生物合成自养同化CO的研究进展。关键词微生物合成自养CO同化异养模式生物自养工程菌生物分为可将有机碳转化为生物质的自养生物和 需要消耗有机化合物的异养生物。过去，生物技术主 要利用异养代谢从简单的碳化合物（如糖或氨基酸）中 生产增值化学品1，2 !近年来,CO作为碳原料在生物 技术中的直接利用引起了广泛

2、的关注W。异养模式生 物变为合成自养是当今合成生物学的一个巨大挑战，而 利用微生物建立一个方便的科学平台，以增强对CO的 固定,这对于解决可持续性食品和生物燃料的生产以及 减缓CO排放引起的全球变暖等问题具有极其重要的 意义。本文概述生物合成自养同化CO的研究进展。 1微生物利用二氧化碳的能力Keller等回在2013年利用一种独特的温度依赖性 方法,赋予了名为强烈火球菌（Pyrococcus f+riosus）利用 CO的能力（强烈火球菌是一种古细菌，其本身在 100B的碳水化合物上生长最佳），这是通过在73C下 自养生长的古生金属球藻（Metallosphaera sedula）的碳 固定

3、循环的5个基因的异源表达实现的。工程菌P. furiosus菌株能够利用氢气作为电子供体与CO中的 碳结合而产生3 -羟基丙酸（3-HP） $ 3 -羟基丙酸是丙 烯酸、丙烯酰、1,3 -丙二醇生产中的12个工业化学主 要组成部分之一，具有重要的工业化学用途。该反应 利用无细胞提取液，以重组嗜热古菌菌株全细胞为培 养基，以糖（麦芽糖）提供乙酰源辅酶A和ATP,以氢 和CO的依赖方式进行培养。此外，反应在低于其最 佳生长温度约30C条件下进行，能够支持最小生长， 但仍保持足够代谢活性，以维持3 -羟基丙酸的生产。该研究将完整的M. sedula 3 -羟基丙酸（3-HP） /4 -羟基丁酸钠（4

4、HB）途径结合在一起，其中CO分子 被还原成乙酰辅酶A,然后进一步转化成各种有价值 的产品，如生物燃料等。已建立的生物合成途径和代 谢工程改造的微生物宿主的超嗜热性，依赖氢的CO 固定,具有生产各种化学品和燃料的巨大潜力。2碳固定途径的异源表达.1 嗜热性光合绿曲菌（Chloroflexus aurantiacus） 3 一 羟基丙醛循环子途径在大肠杆菌中的异源表达 3- 羟基丙醛（3-HPA）循环是独特的CO固定系统，因为 没有任何一个酶受到氧气的影响。此外，3HPA循环 能够产生新的具有研究价值的中间体,且该循环中的 CO固定相对快速。Mattozzi等7在异源生物大肠杆菌 K1中表达了

5、3HPA循环的一部分，将3-HPA循环的 （部分）表达分为4个子途径：由乙酰辅酶A合成丙 酰辅酶A；%由丙酰辅酶A合成琥珀酸;乙醛酸的产 生和乙酰辅酶A的再生;乙醛酸和丙酰辅酶A的同化 形成丙酮酸并再生乙酰辅酶A；最后以操纵子的形式成 功表达3-HPA循环的新型酶，并检测其活性。子途径1激活丙酸盐特异性生物传感器。在非 CO固定细菌中发现的子途径，利用不同来源的基 因在大肠杆菌中重新组装。子途径3反向操作，产生 充足的琥珀酰辅酶A来弥补琥珀酰合成酶双缺失体 （sucAD-） 二氨基庚二酸（DAP）营养缺陷型菌株的需求。子途径4能够降低丙酸的毒性，使得2 -甲基柠 檬酸合成酶（PrpC）突变株能

6、够利用丙酸产生生物质。生长实验的结果表明，3JPA循环的所有酶均在 大肠杆菌中功能性表达、所有子途径在体内都可以在 异源生物中发挥一定的作用。尽管该研究既没有获得 自养生长也没有获得CO2固定表型的工程菌株，不过， 这些结果仍然对代谢工程和通过水平基因转移进行细 菌进化具有重要意义。2. 2 固碳循环（Calvin-Benson-Bassham cycle）在大肠 杆菌中的异源表达研究 Antonovsky等国通过代谢重 组和定向进化使得一个全功能的、非天然的碳固定循 环 Calvin -Benson -Bassham cycle（ CBB 循环）在大肠杆菌 中合成糖和其他主要的生物质成分，同

7、时通过氧化供 应的有机化合物（如丙酮酸）来获取还原力和能量，其 中CO2摄取量只占全部碳摄入量的一小部分,其余碳 源由丙酮酸提供。异源表达核酮糖二磷酸羧化酶（Rubisco）和磷酸 核苷激酶（PRK）原则上可以为大肠杆菌提供执行所有 CBB循环反应所需的酶，有针对性地将能量获取和碳 同化分离成两个独立的代谢系统。但是表达重组 Rubisco、PRK和碳酸酐酶的突变体，以丙酮酸为单一 有机碳源，却不能在高浓度的CO2环境下生长，只有在 提供第二个碳源，即直接供给CBB循环模块的戊糖 （如木糖）时才生长。定向进化是探索所需的多变量微调的有力选择。 因此设计菌株在木糖限制的恒化器中连续进化，恒化 器

8、中木糖的缺乏给细胞施加了强大而持续的选择压 力，这种选择有利于产生突变，并且突变累计速度较适 应性进化突变速率更高，产生了一个功能齐全的CBB 循环，从而使适应半自养生长的工程菌株在种群中占 优势,并不断增殖。基因组测序显示，连接非天然CBB 循环和生物合成途径的通量分支点的突变对这种表型 是必不可少的。结构分析表明，所有核糖磷酸二磷酸激酶的基因 （prs）突变都发生在参与底物结合和催化活性的环内。 PRS催化速率的微调对于代谢稳定性至关重要。2017 年Herz等项证明将中间产物从CBB循环排入,生物合 成的酶的催化能力降低，是在大肠杆菌中建立稳定运行 的异源CBB循环的一个关键因素。非天然

9、固碳途径的成 功进化，虽然还没有导致净碳增益，但显著地展示了适用 于生物技术的新陈代谢的快速营养模式进化的能力。2. 3 已改造的 Calvin-Benson-Bassham cycle 循环在 AM1 型甲基杆菌（Methylobacterium extorquens AM1）的 异源表达研究 Borzyskowski等10设计并实现工程菌 Methylobacterium extorquens AM1 中能量获取和碳同化 解耦,首次实现了菌株仅从非植物原料中提取的C1化 合物甲醇中获得能量，并通过异源Calvin-Benson- Bassham cycle（异源CBB循环）利用CO2合成生

10、物量。当野生型M. extorquens AM1在甲醇上生长时，这 种C1化合物的84%被完全氧化成二氧化碳以获得能 量，而其余的16%的甲醇通过丝氨酸循环和一些相互 连接的途径被同化成生物质。此研究通过敲除巴豆酰 -辅酶A羧化酶基因（ccr）、丝氨酸羟甲基转移酶基因 （glyA）以及甲酸四氢叶酸连接酶的基因（ftfL）来阻止 甲酸盐的同化，并在菌株中异源表达Rubisco过度表 达PRK，从而迫使细胞通过异源CBB循环利用CO2形 成生物量，同时仍然从甲醇氧化中获取能量。通过实验证明异源CBB循环是活跃的，当在含有 5%如2的大气中进行测试时菌株（ftfL和（cel（ftfL突 变菌株出现明

11、显正向表型，并且表型具有高度的可重 复性,很大程度上增强了工程菌株的生存能力。代谢13C示踪分析证实了 AM1中异源CBB循环的 功能性运作，工程菌株的比较蛋白质组学表明宿主细 胞对CBB循环的实现有可塑性的反应，虽然异源CBB 循环不能支持甲基杆菌AM1的完全自养生长，也不能 维持异源固碳途径的长期运行,但其研究代表了合成 自养生物体设计和实现的进一步进展。3大肠杆菌转化CO生产全生物量碳2019年,Gleizer等11通过代谢重新布线和定向进 化，实现了大肠杆菌突变体从二氧化碳中获取全部所 需碳，并能够氧化甲酸盐获得能量和还原力。通过将甲酸脱氢酶（FDH）、Rubisc。和磷酸核苷激 酶（

12、PRK）的基因导入大肠杆菌，CBB循环在大肠杆菌 中实现异源表达，并向菌株导入编码NAD*偶联甲酸脱 氢酶的基因（fdh）,使得工程菌株可从可再生资源电化 学生产的甲酸盐中获取能量，因为甲酸盐是一种有机 碳化合物，不能作为大肠杆菌的碳源，所以不支持异养 途径,保证了工程菌的完全自养。为使大肠杆菌能够固定二氧化碳，将菌株中参与 异养生长的三个基因失活，使细菌更依赖自养途径生 长；同时对工程菌进行了一年的连续传代培养，其间只 给它们微量的木糖来培养细胞,并提供浓度为地球大 气250倍的二氧化碳和大量甲酸盐。在这种环境下， 自养生长更具优势,工程菌发生突变以适应选择压力。 在大约200 d后，以二氧化碳为唯一碳源的细胞产生。 同位素标记证实所有生物质组分均由二氧化碳作为唯 一碳源产生。通过对进化的自养细胞的基因组和质粒进行测序 发现，在进化过程中仅获得了 11个突变：有些发生在 与碳固定相关的基因中，而有些是其他进化实验中发生的已知突变或发生在利用二氧化碳产生生物量中未 起到已知作用的基因中。这项研究首次描述了细菌生长方式的成功转化， 使得肠道细菌以类似植物的方式生存。令人惊