高效液相色谱法测定火腿肠食品中防腐剂含量的方法

1、超声提取-固相萃取-高效液相色谱法测定火腿肠防腐剂含量的方法摘要:针对火腿肠食品特点，对液相色谱法测定火腿肠中苯甲酸、山梨酸的样品 处理方法进行研究，建立了有效的高效液相色谱法测定火腿肠食品中防腐剂含量 的样品处理方法。关键词：火腿肠食品特点;高效液相色谱法;测定；防腐剂含量1、引言火腿肠是深受广大消费者欢迎的肉类食品，为防止食品变质，生产厂家常在火腿 肠中加入防腐剂。我国目前常用食品防腐剂主要有苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其 钾盐为主。火腿肠中苯甲酸和山梨酸的测定样品处理方法，在国标GB/T5009. 29 -2003中苯甲酸、山梨酸测定的液相色谱法中，只规定了饮料和配制酒样品处 理方法，其它样

2、品处理没有提及。火腿肠食品中含高蛋白、高脂肪及淀粉等基质 成份较多，并且苯甲酸、山梨酸具有脂溶性的性质决定了样品处理的复杂性。本 文针对火腿肠食品特点，对液相色谱法测定火腿肠中苯甲酸、山梨酸的样品处理 方法进行研究，建立有效的高效液相色谱法测定火腿肠食品中防腐剂含量的样品 处理方法。2、实验2.1仪器与试剂2.11仪器2台LC-10Tvp梯度高效液相色谱仪（配置LC-10Tvp高压恒流泵）；一台SPD-10Tvp 紫外检测器；一台SCL-10Tvp系统控制器；一套7725i手动进样阀；一套色谱 工作站（VI2010，N2000，N3000 选用）；液相色谱柱：1 支 （C18 4.6*250m

3、n， 5um）；微量进样器：1支（50ul/100ul）；进样支架：1只（进样阀用） 2.12试剂火腿肠市售。苯甲酸（分析纯，99.5%）、山梨酸（化学纯，99.0%）、乙酸铵（分析 纯，98.0%）、乙酸铅（分析纯，99.5%）溶液（379.33g/L）国药集团化学试剂有限公司； 甲醇（色谱纯，99.9%）、三次去离子水。2.2方法2.2.1标准贮备液的配制分别称取山梨酸0.1000g，苯甲酸0.1000g，加入8ml20g/L NaHCO3溶液，定容 于100ml容量瓶，配成1.0mg/ml标准贮备液。2.2.2色谱参数和条件岛津色谱柱 VP-ODS（250mmx4.6mm，5pm）；进样

4、量：201 ；检测波长：230nm； 灵敏度0.02AUFS。2.2.3样品制备超声提取称取2.0g火腿肠，经研钵研碎后置于25ml比色管，加5ml水，经80。水浴加热 30min后，超声提取30min，以10000r/min高速离心5min，取上清液至25ml容 量瓶，定容至刻度。固相萃取净化：取C18 SPE固相萃取小柱依次用5ml甲醇 和3ml水活化后，再通过5ml样液，用5ml甲醇淋洗，弃去淋洗液，再用5ml 水以一定的速度洗脱，收集洗脱液2.5ml容量瓶，经过0.45pm滤膜过滤后，用 HPLC分析。3结果与分析3.1色谱条件的优化3.1.1流动相的组成及配比的选择流动相是色谱分离中

5、十分重要的影响因素，直接关系到分析的灵敏度、检出限， 决定着能否将样品的组分洗脱分离。苯甲酸、山梨酸在不同的组成及不同的比例 时的分离效果，由表1可见，流动相为0.02mol/L乙酸铵：甲醇体积比为95:5时的分离效果好。表1不同组成和配比的流动相的分篱效果Tabls 1 Effectivensss of different fiubils ptiaEBS for His separation of subic acid and benzoic acid流动相水:甲醇 *H)2h：ioV.WEi却儿召酸殴甲醇甑比，VVi阳顶乙酸铉:甲醇I归亍I祯)，3出2流速的选择，二-三1- -本实验分别选

6、择鼠8、us态孙命射肺组 作为流动相的流速，结果显示，流速为 1.0ml/min时洗脱的山梨酸和苯甲酸的量，比1.2ml/min时的多，并已能较为完全的洗脱， 分离效果理想，不干扰测定；而选择0.8ml/min作为流速，则分析时间过长。综 上述情况，选择1.0ml/min作为流动相的流速。3.2标准曲线绘制及相关系数测定分别移取1.0、2。0、3.0、4.0、5.0ml 1.0mg/ml的苯甲酸、山梨酸标准贮备液于 50ml容量瓶，用水定容至刻度，配成浓度分别是20、40、60、80、100mg/L的 标准溶液，经0.45pm滤膜过滤后，取20pl注入色谱仪，测定峰面积，以峰面积对浓度(mg/

7、L)作标准 曲线。苯甲酸线性方程为y=2867x+876.78，相关系数0.9986；山梨酸线性方程 为y=4469.9x+1928.6，相关系数0.9989。本法苯甲酸和山梨酸在20100mg/L 范围线性很好。3.3样品前处理方法的优化3.3.1样品净化方法的选择用水提取的样品液中杂质非常多，含有较多的水溶性蛋白质，如果不进行净化而 直接进行液相色谱分析，将严重影响色谱柱的使用寿命。殷茂荣等8采用添加 蛋白质沉淀剂的方法对样品进行净化。分别采用以C18 SPE小柱和加入乙酸铅 (379.33g/L)作为蛋白质沉淀剂两种方法净化样品，乙酸铅的加入量为3ml。实验 结果表明，经过C18 SPE

8、小柱净化山梨酸提取量为22.706mg/L，乙酸铅作为蛋 白质沉淀剂净化山梨酸提取量为17.202mg/L。采用乙酸铅作为蛋白质沉淀剂， 会对山梨酸造成损失。因此，本实验选择固相萃取方法净化样品。3.3.2洗脱流速由于C18 SPE小柱对目标物有吸附作用，因此洗脱液的流速对洗脱量也有影响， 实验发现减慢流速可增加洗脱量，经实验，选择以1.0ml/min的洗脱速度洗脱。 3.3.3防腐剂提取方法的选择方法加热山梨酸峰面租贝996.406K7219.00（1平均值K942CL234含9374RSDi：%3项）实验号提取时间 提取崖1W2(HHH2202O.K2333仆22.70644022.702

9、楠旧5.297102626.000超声叩州切3WK79.I02K5536.594KB33K.36K22.6K73.74振荡WH9HRJDOOKK273.2O3SS265.93219.3153.09表2不同提取方法对比Table 2 Comparison of subic acid extraction by different methods表3超声时间对提取量的影响Table 3 Effects of ultrasonic treatment time o(i extraction uf sobic acid分别称取3份2.0g火腿肠与25ml比色管，加5ml水于80C水浴30min,标号1

10、、 2、3将1号比色管置于80C恒温水浴中，加热30min, 2号比色管超声30min, 3号比色管于水浴恒温振荡器中振荡30min，按2.2节所述色谱条件进行分析， 每种提取方法平行测定3次。表2结果显示，超声提取的提取量高于加热和振荡 提取。3.3.4超声提取时间取4份2.0g火腿肠于25ml比色管，分别标号1、2、3、4.各加5ml水，于80C 水浴加热30min，1号超声10min，2号超声20min，3号超声30min，4号超声 40min，按照2.2.3方法进行分析，结果见表3,显示超声提取30分钟效果较好。 3.4.检出限以样品被测组分峰高为基线噪音3倍时的浓度为最低检出浓度，苯

11、甲酸的检出限 为1.47p g/kg，山梨酸的检出限为0.86p g/kg。3.5加标回收率实验不同加标水平的苯甲酸、山梨酸的回收率为101.79%105.28%，其相对标准偏 差小于等于1.84%。表5二梨酸却芸甲酸的回收率和用对标准偏恙表5二梨酸却芸甲酸的回收率和用对标准偏恙（.3）本底值坦）加标值删里值顷回吸率,RSD%)0.1141.0191.167103.31mw山梨酸fl.1141.5221.716J05J2H0.79fl.1142.0312.24KHH.410.72OUOOO0.WK1.016101.79“.46苯甲酸OUOOO1.521J76fk67(IW02,0362.mi102701.S4Table 5 Recuveries uf subic acid and benzoic acid at three spiked levels (f?=3)时间mill |图1火庞肠硅吕液相色i普图Fig.1 HPLC cfirornatcgrarn of extra-ut of harn sausage sarnple3.6样品测定由图1可见，市售火腿肠中山梨酸（SA）的含量为22.7