大肠菌群的测定DC法课件

大肠菌群的测定

——DC半固体试管快速法大肠菌群的测定

——一、实验目的

熟练的掌握大肠杆菌的测定方法通过大肠杆菌的测定了解大肠杆菌的特性熟练掌握MPN检索表的使用方法。熟悉DC半固体试管快速法的操作过程

熟练掌握操作技术一、实验目的熟练的掌握大肠杆菌的测定方法二、实验原理大肠菌群是一群能发酵乳糖、产酸、产气（故能使培养基变色、有气泡产生或琼脂崩裂）、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。主要源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。

二、实验原理大肠菌群是一群能发酵乳糖、产酸、产三、实验器材小试管（7支）大试管（3支）量筒（100毫升的1支）移液管1ml（3支）5ml（1支）10ml(1支）锥形瓶250ml（1个）烧杯250ml(1个）玻璃棒均质袋纱布线剪刀报纸油皮纸棉塞洗耳球接种针恒温灭菌箱恒温水浴锅培养箱天平酒精灯火柴精密PH试纸标签纸样品：面包三、实验器材小试管（7支）大试管（3支）四、药品配置安氏指示剂的配制：酸性复红0.5g、蒸馏水100ML、氢氧化钠（IN）16ML制法：将酸性复红溶解于蒸馏水中，加入氢氧化钠溶液数小时后如复红退色不够。可再加1～2毫升氢氧化钠液。BTB指示剂的配制：溴化麝香草酚蓝指示剂、溴化麝香草酚蓝0.1g、氢氧化钠16g制法：将两者在研钵研磨混合，加水稀释至250ml，制成0.04%BTB溶液。四、药品配置安氏指示剂的配制：酸性复红0.5g、蒸馏水100五、实验步骤（一）清洗包扎吸管

洗净烘干后的吸管，在口吸的一端用尖头摄子或针塞入少许脱脂棉花，以防止菌体误吸口中，每支吸管用一条宽约4~5厘米，以45°左右的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，吸管的另一端用剩余纸条迭打结，不使散开，标上容量。若干支吸管扎成一束，灭菌后，同样要在使用时才从吸管中间拧断纸条抽去吸管试管和三角瓶

试管和三角瓶都要作合适的棉花塞。棉花塞的作用是起过滤作用，避免空气中的微生物进入试管或三角瓶。棉花塞的制作要求使棉花塞紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，棉花塞的长度不少于管口直径的二倍，约2/3塞进管口

若干支管用绳子扎在一起，在棉花塞部分外包，油纸或牛皮纸再在纸外用绳扎紧。三角瓶每个单独用油纸包扎棉花塞。

五、实验步骤（一）清洗包扎（二）灭菌1、干热灭菌培养皿、移液管及其他玻璃器皿可用干热灭菌。先将已包装好的上述物品放入电热干燥箱中，将温度调至160℃后维持2h,结束时把干燥箱的调节旋钮调回零处，待温度降到50℃左右，将物品取出。

注意事项

此过程中应注意温度的变化、不得超出170度，避免包装纸烧焦和其他不安全情况。灭菌好的器皿应保持完整的，否则易染菌。（二）灭菌生理盐水1.成分Nacl0.9g,蒸馏水100ml2.制法一般每种检样配制250ml生理盐水。称取2.2gNacl，加入250ml蒸馏水溶液；分装于2支大试管中，每支9ml，再量取225ml装入500ml广口瓶中，并加入适量的玻璃珠；剩余的装人另1支试管中，包扎后于121度高压灭菌15min。生理盐水1.成分Nacl0.9g,蒸馏水1002、湿热灭菌将培养基、均质袋及各种耐高温湿物品放入高压蒸汽灭菌器内，加压至1.05kg/cm2即温度达121.3℃，15～20分钟，可杀灭细菌芽胞和各类微生物。注意事项

无菌包不宜过大（小于50cm×30cm×30cm），不宜过紧，各包裹间要有间隙，使蒸汽能对流易渗透到包裹中央。消毒前，打开贮槽或盒的通气孔，有利于蒸汽流通。而且排气时使蒸汽能迅速排出，以保持物品干燥。消毒灭菌完毕，关闭贮槽或盒的通气孔，以保持物品的无菌状态。

2、湿热灭菌将培养基、均质袋及各种耐高温湿物品（三）培养基的制备1.成分蛋白胨1.5g氯化钠0.5g乳糖1gK2HPO4.3H2O0.3g柠檬酸铁铵0.2g琼脂粉（或琼脂条0.8g）0.7g安氏指示剂2ml蒸馏水100ml2.制法将以上固体成分加热溶解于水，调整PH7.2，随即加入两组指示剂与10%去氧胆酸钠水溶液，最后煮沸3分钟备用。3.注意事项制备DC培养基不需高压灭菌，做好后培养基为绿色，未用完DC琼脂可加热煮沸，待冷后保存于冰箱中继续使用，有效期为一年3倍DC半固体培养基，其中除蒸馏水用量不变外，其他成分按3倍量加入，制法同上制备DC培养基，其中10%去氧胆酸钠水溶液要求在校正PH后加入，以免发生胆酸沉淀（三）培养基的制备

（四）检验方法样品处理取面包25g，用剪刀剪碎，用100ml水溶解，用均质器打成浆，再用纱布过滤。接种吸取原液3个1ml，分别注入3个灭菌的试管内：再吸取1：10、1：100稀释液各3个1ml分别加入灭菌的试管内，每管1ml。加入培养基与培养接种1ml样品的试管，注入已溶化并冷至50c左右DC半固体培养基3ml。立即将样品与培养充分混合，待凝固后，36±l℃温箱内，培养24±2小时，取出观察结果。（四）检验方法

六、结果判定1.培养基变橘红色，有气泡产生或琼脂崩裂，记录为“⊕”2.培养基为橘红色，或有橘红色菌落无气泡和琼脂崩裂现象，记录为“+”3.培养基为绿色，有黄色菌落无气泡和琼脂崩裂现象，记录为“±”4.培养基为绿色，记录为“－”六、结果判定1.培养基变橘红色，有气泡产生或琼脂崩裂，记七、报告结果1.根据判定结果，记录阳性管数，直接查对MPN检索表，做报告。2.如遇“结果判定”中“2”、“3”反应结果，可挑2~3个可疑大肠菌落接种乳糖复发酵管，置37℃温箱18~24h，根据产酸产气管数查对MPN表，做报告。七、报告结果1.根据判定结果，记录阳性管数，直接查对MPN乳糖发酵管

成分蛋白胨20g乳糖10g0.04%溴甲酚紫水溶液25mL蒸馏水1000mLpH7.4

制法将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，按检验要求分装3mL，并放入一个小倒管，115℃高压灭菌15min。乳糖发酵管成分检验方法样品处理取可疑大肠菌群菌落，用盐水溶解。接种吸取原液3个1ml，分别注入3个灭菌的试管内：再吸取1：10、1：100稀释液各3个1ml分别加入灭菌的试管内，每管1ml。加入培养基与培养接种1ml样品的试管，注入已溶化并冷至50℃