2第二章-基因工程的酶学基础

第二章基基因因工程的的酶学基基础Enzymes一、限制制性核酸酸内切酶酶第一节限限制制性核酸酸内切酶酶是一类能能够识别别双链DNA分子中的的某种特定核苷苷酸序列列，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。（Restrictionendonuclease））2.性质内切酶主要来源于原原核生物即在核酸分子子链的内部制造切口的酶酶。形成5’-P和3’-OH末端自我保护作用用3.功能细菌的限制和和修饰系统（（R/M体系系）1.来源由寄主控制的的限制和修饰现现象---20世纪60年代，Linn和Arber发现(B)(K)大肠杆菌B大肠杆菌K114×10—410—4E.O.P成斑率efficiencyofplating外源DNA自身DNA核酸限制性核核酸内切酶的的发现：切酶。E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识识别的碱基序序列，被降解解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在在这种特异序序列，但可在在EcoB甲基化酶的作作用下，催化化S-腺苷甲硫氨酸酸（SAM）将甲基转移移给限制酶识识别序列的特特定碱基，使使之甲基化。。EcoB核酸酶不能识识别已甲基化化的序列。限制—修饰的酶学系系统(B)(B)酶切位点不被修饰噬菌体DNA被切割酶切位点被修饰基因组DNA不被切割Ⅰ型限制性性内切酶目前鉴定出三种不同类型型的限制性内切切酶。二、限制性内内切酶的类型型Ⅱ型限制性性内切酶Ⅲ型限制性性内切酶IV型限制性内切切酶限制性核酸内内切酶的类型型及其主要特特性特性1.限制修饰活性性2.内切酶的蛋白白质结构3.限制辅助因子子4.切割位点5.特异性切割6.基因克隆中I型双功能的酶3种不同亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸酸距特异性位点点5‘端至少1000bp不是（随机））无用II型限制酶和修饰饰酶分开单一成分Mg2+位于识别位点点上是非常有用III型双功能酶2种亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸酸特异性位点3‘端24-26bp处是用处不大1973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名名系统，命命名原则如如下：三、限制性性内切酶的的命名用属名的第一个字字母和种名的头两个字字母组成3个字母的略略语表示寄主菌的物种名，，组成酶的的基本名称称。大肠杆菌（（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示2.如果酶存在在于一种特殊的菌株株中，则将该该菌株名的的第一个字字母加在基基本名称后后，若酶的的编码基因因位于噬菌体（病病毒）或质质粒上，则用一一个大写字字母表示此此染色体外外遗传成分分。如HindⅡ：d菌株EcoRI：抗药性R质粒3.如果一种特特殊的菌株株内有几种种不同的限限制与修复复系统，用用罗马字母母表示该菌菌株中发现现某种酶的的先后次序。如HindⅡ：d菌株中发现现的第二个个酶4.所有的限制制酶，除以以上名称外外还要冠以以系统名称。限制性内内切酶的系系统命名为为R，甲基化酶酶为M。如R.HindⅢ表示限制性性内切酶M.HindⅢ表示相应的的甲基化酶酶实际应用中中，R常被省略。。首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜嗜血菌中分分离出来。。（1）识别位点点序列未甲基化修修饰的双链DNA上的特殊靶靶序列（多多数是呈典典型的旋转转对称型的的回文结构构）4-6bp。与DNA的来源无关关，即没有种的特特异性。四.Ⅱ类类限制性内内切酶的基基本特性分离的第一一个酶是HindⅡ稀有切割限限制酶（rarecutter）可以识别6个以上的核核苷酸序列列的少数的的限制内切切酶。如NotI（GCGGCCGC）某些限制性性内切酶的的识别序列列中，某一一个或两个个碱基并非非严格专一一。如HindⅡ可识别4种核苷酸序序列：Y:C或TR:A或GGTYRAC-3’5’-EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

产生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

产生平齐末端（2）切割位点切开开双链链DNA，形形成成粘性性末末端端（stickyend）或或平齐齐末末端端（bluntend）。。如如：：识别别位位点点处处含有有几几个个核核苷苷酸酸单链链的末末端端。。分两两种种类类型型：：GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5’’--3’’3’’--5’’5’’--3’’3’’--5’’[1]粘性性末末端端（stickyends，cohensiveends）ⅰ）5’’端凸凸出出（（如如EcoRI切点点））CTGCAGGACGTC5’’--3’’3’’--5’’5’’--3’’3’’--5’’CTGCAGGACGTCⅱ）3’’端凸凸出出（（如如PstI切点点））i）不同的的DNA双链：：只要粘粘性末末端碱碱基互互补就就可以以连接接。这比连连接两两个平平齐末末端容容易得得多。。[2]粘性末末端的的意义义①连接便便利ii）同一个个DNA分子内内连接接：通过两两个相相同的的粘性性末端端可以以连接接成环形分分子。[3]平齐末末端（（bluntend）在识别别序列列的对称轴轴上同时切切割5’-GATATC-3’’3’--5’’CTATAG如EcoRV不同来来源的的酶，，识别相相同的的序列列，切割方方式相相同或或不同同。识别位位点和和切点点完全全相同同如HindⅢ和HsuIHindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’’HsuI5’’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’’[5]同裂酶酶（Isoschizomer)①完全同同裂酶酶：XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’识别位位点相相同，，但切切点不不同。。如XmaI和SmaI。②不完全全同裂裂酶：：识别的的序列列不同同，但但能切出相相同的的粘性性末端端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’’5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤呤；Y代表嘧啶啶。[6]同尾酶(Isocaudamers）限制性内内切酶的的识别和和酶切活活性一般般在一定定的温度、离离子强度度、pH等条件下下才表现现最佳切切割能力力和位点点的专一一性。如果改变变反应条条件就会会影响酶酶的专一性和和切割效效率，称为星星号（*）活性性。所以一般般使用专专一的反反应缓冲冲液。影响限制制酶的酶酶活性的的因素星号（*）活性性EcoRI和BamHI等都有*活性。。在低盐、、高pH（>8）时可识识别和切切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的时时候要特特别注意意！7诱发星号号（*））活性的的原因ⅰ）高甘油油含量ⅱ）内切酶酶用量过过大ⅲ）低离子子强度ⅳ）高pHⅴ）含有机机溶剂，，如乙醇醇ⅵ）Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+等二价阳阳离子的的存在酶量不宜宜过多，，尽量遵遵循生产产商推荐荐的反应应条件从细菌DNA环化现象象推测，，必定存存在一种种能把两两条DNA双链连接接到一起起的酶。。第二节DNA连连接酶一、DNA连接酶（（ligase)的发现DNA复制一定定有断口口DNA连接酶:一种能够够催化在在两条DNA链之间形形成磷酸二酯酯键的酶1967年，世界界上数个个实验室室几乎同同时发现现了一种种能够催催化在2条DNA链之间形形成磷酸二酯酯键的酶，即即DNA连接酶。。（1）大肠杆杆菌连接接酶1.两种共价价连接DNA限制片段段的DNA连接酶连接粘性末端端，准确性性高,NAD+齐平末端端，效率率低二、DNAligase的的特点（2）T4噬菌体的的连接酶酶不但能连连接粘性性末端；；还能连连接齐平平末端DNA-DNARNA-RNADNA-RNAATP（1）必须是是双链DNA（2）DNA3’端有游离离的-OH，5’端有一个个磷酸基基团（P）（3）需要能量ATP或NAD+2.DNA连接酶催催化的连连接反应应特点（4）只能连连接缺口口（nick），不能连接接裂口（（gap）。是两条链链－因此不能能将两条条单链连连接起来来或使单单链环化化起来。。OHP××××是相邻的的－因此只能能封闭nick.不能封闭闭gapgapNONickOK三、DNA连连接酶的的反应条条件Tris-HCl50-100mM，pH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃，4-16hr1.反应温度理论37℃黏性末端：12～16℃平头末端：10～20℃2.ATP浓度一般，ATP最适的终浓度度为0.5mmol/L.ATP浓度高至5mmol/L，影响平头末末端的连接ATP浓度高至7.5mmol/L，抑制粘性末末端及平头末末端的连接。。四、影响连接接反应的因素素3连接酶的浓度度：平末端DNA分子的连接反反应中，最适适1～2个单位。粘性末端DNA片段之间的连连接，0.1个单位。时间：16℃4小时4℃过夜增加插入片段段与载体的接接触机会，减减少同一个分分子末端自我我连接的现象象。4.DNA末端的浓度3:1插入片段与载载体的浓度比比例两种构型：线线状分子和环环状分子与DNA浓度及DNA分子长度相关注意事项：10xLigationBuffer含有ATP，使用前应在在室温放置至至融化或用手掌温度辅助融化，然然后置于冰上上。不要加热热融化以免ATP降解。T4DNALigase对热敏感，容容易失活。使使用时请放置冰上，用后立即置置冰箱中冷冻保存。。第三节DNA聚合酶酶和反转录酶酶DNA聚合酶（DNApolymerase)能在引物和模板的存在下，把把脱氧核糖多多核苷酸连续续地加到双链DNA分子引物链的3’－OH末端，催化核核苷酸的聚合合作用.一、基因工程程中常用的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修饰过的T7DNA聚合酶6.逆转录酶7.TaqDNA聚合酶1.共同特点把dNTPs连续地加到引引物的3’－OH端2.主要区别T7DNA聚合酶可以连续添加加数千个dNTPs而不从模板上上掉下来。有的DNA聚合酶只能连连续添加10多个dNTPs就会从模板上上解离下来。。二、常用的DNA聚合酶酶的特点持续合成能力力和外切酶活活性不同。DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高3.常用DNA聚合酶酶的特性比较较三、DNA聚聚合酶在基因因工程中的用用途1.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ主要用来制备备带放射性标标记的DNA探针（32P标记）。（1）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的性质①一条单链多肽②5’3’外切酶活性位位于N端③用枯草杆菌蛋白白酶处理可以切掉掉N端的5’3’外切酶活性部分,就成为Klenowfragment。2.Klenowfragment具有5’3’聚合酶活性和和3’5’外切酶活性。。（失去了5’3’外切酶活性）。（1）Klenowfragment的性质DNAPolIKlenowfragment(76KD）枯草杆菌蛋白白酶①3’端补平5’5’klenow②DNA3’末端标标记补平限制性内内切酶切后形形成的3’隐蔽端。在3’隐蔽端加上放射性性标记的dNTP。klenow（2））主主要要用用途途3’’隐蔽蔽末末端端的的DNA片断断Klenowfragment补平平根据据末末端端的的顺顺序序选选择择一一种种-32P-dNTPs末端端标标记记的的DNA限制制性性内内切切酶酶切切5’’----G3’’3’’----CTTAA5’’5’’----GAA3’’3’’----CTTAA5’’5’’----GAATT3’’3’’----CTTAA5’’5’’----G3’’3’’----CCTAG5’’5’’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25oC1h③cDNA第二链的合合成mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenow5’3’3’5’5’3’引物（1）T4DNA聚合酶的性质质3.T4DNA聚合合酶从T4噬菌体感染后后的大肠杆菌菌培养物中分分离纯化，由由噬菌体基因43编码。有5’3’聚合酶活性和和3’5’外切酶活性（（降解单链更更快）。①来源②酶酶活性性③特特点A当没有有dNTP时，T4DNA聚合酶酶行使使3’5’外切酶酶功能能，制制造出出3’隐蔽端端。B如果只只有一一种dNTP，则降降解到到该dNTP的位置置。C在四种种dNTP均存在在时，，聚合合活性性占主主导地地位。。5’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶无dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’5’（2）T4DNA聚合酶酶的用途标记末端（（取代合成成法或置换换合成法））用3’5’’外切酶活性性作用于所有末端形形式的3’端（平端、3’隐蔽端、5’隐蔽端）制制造出3’隐蔽端。再利用它的的5’3’聚合酶活性性补平，并并加入放射射性标记的的dNTP。①补平隐隐蔽末端②DNA3’末端标记4.T7DNA聚合酶（1）来源从T7噬菌体感染染大肠杆菌菌细胞中纯纯化出来的的，由两个个亚基组成成：①T7噬菌体基因因5编码的大亚亚基：T7噬菌体5蛋白有5’3’聚合酶和3’5’外切酶活性性。②大肠杆杆菌编码的的小亚基：：硫氧还蛋白白增加大亚基基对模板的亲和和性。（2）T7DNA聚合酶的的特点①持续合合成能力强强一旦与模板板结合就会会不间断地地合成互补补链。②3’5’外切酶活性性高单链和双链链都能降解解。③不受受DNA二级结构构的影响响其它DNA聚合酶受受DNA二级结构构的阻碍碍②进行行末端标标记①