PCR技术概述授课课件

PCR技术PCR技术

PCR（PolymeraseChainReaction)技术即聚合酶链反应，又称DNA体外扩增技术。

1985年由美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明的一种具有划时代意义的分子生物学技术，被誉为无细胞分子克隆。

PCR（PolymeraseChainReac一、PCR技术的创建Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。

1985年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。

1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术

1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。一、PCR技术的创建Khorana(1971)等提三篇重要论文TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction(ScientificAmerican,1990,262(4):56-61,64-5)Primer-directedEnzymaticAmplificationofDNAwithaThermostableDNAPolymerase(Science,1988,239(4839):487-91

)SpecificSynthesisofDNAInVitroviaaPolymeraseCatalyzedChainReaction(MethodsinEnzymology,1987,155:335-50)

三篇重要论文TheUnusualOriginofth引物引物1983年Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段引物引物1983年Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合94℃变性50-65℃退火XX℃延伸94℃变性50-65℃退火XX℃延伸DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，缺点：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加入。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片

1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。

1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行P1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶IKlenow片段区别，将此酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。

1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thTaq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)40506070809010010080604020TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶二、PCR技术的原理1PCR技术的基本原理在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。二、PCR技术的原理1PCR技术的基本原理在微

体内DNA的复制DNA聚合酶

dNTP解旋酶类引物5’

3’知识点回顾体内DNA的复制DNA聚合酶dNTP解旋酶类加热变性复性复温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA的变性。解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。

加热变性复性复温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以PCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火PCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退2PCR技术的特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍2PCR技术的特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达2302）特异性

引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。引物引物2）特异性引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR3’5’3’5’限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记3’5’3’5’限制性内切酶的识别序列3）操作简便易行

PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。

通常的DNA扩增法是分子克隆法,首先要构建含有目的的基因的载体,然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位素探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。3）操作简便易行PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电目的基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取DNA分子目的基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取DNA分子4）对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用各种生物标本（如血液、体腔液、毛发、细胞、活组织等）粗制的DNA扩增检测。4）对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA5）用途广泛生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学5）用途广泛生命学科三、PCR的反应体系和方法

PCR管加热使模板变性,退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温(72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。三、PCR的反应体系和方法PCR管加热使模板变性,退

总体积50-100l

Buffer

缓冲液

dNTP

原料

Primer

引物

DNA分子

模板

Taq酶

DNA聚合酶

1反应体系总体积PCR技术的基本过程(1)模板DNAdNTP引物Buffer预变性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC2基本过程PCR技术的基本过程(1)模板DNA预变性模板DNATaPCR技术的基本过程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循环仪94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7min循环25～35次PCR技术的基本过程(2)Taq酶循环仪94℃Taq酶7琼脂糖凝胶电泳PCR技术的基本过程(3)琼脂糖凝胶电泳PCR技术的基本过程(3)（1）模板

单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。3PCR反应条件（1）模板3PCR反应条件（2）引物Ⅰ引物合成的质量PCR所用引物质量较高，且需纯化。合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高效液相层析纯化，减少发生非特异扩增和信号强度的降低。冻干引物于-20℃可以保存12-24个月，甚至更长，液体状态-20℃可以保存6个月或更长。

（2）引物Ⅱ引物设计的一般原则（1)引物长度

特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。长度以15-40bp为宜。引物长度增加，能提高特异性，但在退火时被引发的模板会减少，降低反应效率。实际应用中最适延伸温度不要超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃）。Ⅱ引物设计的一般原则（2）引物的3‘末端和5’末端核苷酸

引物3’端为关键碱基，是PCR延伸的起始端，不能进行任何修饰，也不能形成二级结构的可能，一般3‘端也不能发生错配；

5’端无严格限制，只起限定PCR产物长度的作用，对扩增特异性影响不大，可以被修饰。（2）引物的3‘末端和5’末端核苷酸（3）GC的含量

一对引物的GC含量和Tm值应该协调，G+C一般占40-60%。根据公式Tm=4（G+C）+2（A+T）,可估计引物的Tm值。（3）GC的含量（4）两引物间避免有互补序列，尤其避免3’端的互补重叠。一般来讲，引物自身连续互补碱基不能超过3个，一对引物间也不易多于四个连续碱基的互补性。（4）两引物间避免有互补序列，尤其避免3’端的互补重叠。（5）碱基的随机分布

选择缺乏连续单一核苷酸的区域作为引物序列，这样可以减少引物-引物同源互补的机会。也要注意引物在长度和碱基组成上的平衡，两个引物的Tm值相差2-3℃范围内。（5）碱基的随机分布（6）引物内部避免形成二级结构。采用计算机软件可以预测估计mRNA的稳定的二级结构，有助于选择模板。（6）引物内部避免形成二级结构。Ⅲ引物浓度0.1-1mol/L

引物浓度过低，PCR产物量下降。浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降，还会增加引物二聚体的形成。非特异性产物和引物二聚体又可作为PCR反应的底物，与靶序列竞争DNA聚合酶和dNTP底物，使靶序列的扩增量降低。Ⅲ引物浓度0.1-1mol/L（3）循环参数Ⅰ变性的时间与温度

不同的DNA解链温度不同，由于DNA中GC与AT的比例不同引起的。GC比例越大，解链温度越高。一般GC含量每增加1%，解链温度就增加0.4℃。典型的变性条件是95℃30s或97℃15s。（3）循环参数Ⅰ变性的时间与温度过高使聚合酶失去活性，过低DNA变性不完全。变性温度在90-95℃时，既能保证使DNA双链模板变性，又能保持Taq聚合酶活力。因此PCR变性温度在90-95℃之间选择，时间为30-60s。过高使聚合酶失去活性，过低DNA变性不完全。Ⅱ退火时间与温度退火温度决定着PCR的特异性。引物复性所需的温度与时间取决于引物的碱基组成、长度。范围一般在25-65℃，低于引物Tm值5℃

左右。在典型的引物浓度时，退火时间一般为40-90s，过短会导致引物与模板DNA互补配对失败。Ⅱ退火时间与温度退火温度决定着PCR的特异性。Ⅲ延伸时间与温度延伸时间的长短取决于待扩增的模板序列的长度与浓度，以及延伸温度高低。引物延伸在70-74℃下进行，根据扩增DNA的长度而确定，一般延伸30-90s。Ⅲ延伸时间与温度延伸时间的长短取决于待扩增的模板序列的长度与Ⅳ循环次数的确定以既达到扩增效果又尽量减少非特异性产物的扩增为原则，PCR的循环次数一般在25-35次。循环系数过多将增加非特异产物；循环次数太少，产率偏低。因此在得到足够产物的条件下应尽量减少循环次数。Ⅳ循环次数的确定以既达到扩增效果又尽量减少非特异性产物的扩增经典循环参数（500bp以内）94℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃7min4℃forever经典循环参数（500bp以内）94℃30（4）Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus

0.5-2.5U/50l

酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。催化DNA合成的温度以70-80℃为宜。高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。（4）TaqDNA聚合酶（thermusaquaticu（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度，可适当提高Mg2+的用量。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。（6）dNTP

dNTP浓度取决于扩增片段的长度，一般为50-200umol/L;四种dNTP浓度应相等,过高或过低导致错误渗入增加，终止反应；浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量；

dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。（6）dNTP（7）其他辅助试剂加入一定浓度的添加剂如DMSO（二甲基亚砜）、甘油或甲酰胺等，可提高PCR扩增效率及特征性。

可能是消除了引物和模板的二级结构，降低DNA双链的解链温度，使DNA双链完全变性所致。还可加入牛血清白蛋白、明胶、Tween20或二硫苏糖醇（DTT），有助于酶的稳定。（7）其他辅助试剂加入一定浓度的添加剂如DMSO（二甲基亚砜1）不对称PCR

目的：扩增产生特异长度的单链DNA。

方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。

四、PCR的类型1）不对称PCR四、PCR的类型2)反向PCR(reversePCR)

是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。

可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列2)反向PCR(reversePCR)是用反向的已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶3）多重PCR（复合PCR）在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同.

3）多重PCR（复合PCR）在同一PCR反应体系用于检测特定基因序列的存在或缺失。或用于多种病原微生物的同时检测或鉴定，某些遗传病及癌基因的分型鉴定。多种病原微生物的同时检测或鉴定，是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染。

用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物12341234电泳引物123412344）LP-PCR（Labelledprimers)利用同位素、荧光素等对PCR引物5’端进行标记，据此检测目的基因的存在与否.

一次可以同时分析多种基因成分，因而特别适合于大量临床标本的基因诊断。目前该方法只对PCR产物进行定性鉴定。

病毒1病毒2病毒3病毒44）LP-PCR（Labelledprimers)标记引物ＰＣＲ观察PCR产物标记引物ＰＣＲ观察PCR产物5）锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）PCR的局限：需了解靶基因片段两测的序列

对于未知序列和具有不同末端序列怎么办？（固定化PCR）5）锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）PCVHCH1CH1CH2CH2CH3CH3VHVLVLCLCLVHCH1CH1CH2CH2CH3CH3VHVLVLCLCLcDNA末端核酸转移酶3’GG…GG5’CC…CC锚定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3’锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增cDNA末端核酸转移酶3’GG…GG5’CC…CC锚定引带有PolyC尾巴的引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明A-PCR不对任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位抗体基因的研究。带有PolyC尾巴的引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾6）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR扩增探针亲和固相介质检测探针信号可用于基因芯片的制作6）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR扩增探针亲和固相介7）原位ＰＣＲ

原位聚合酶链式反应（InStillPCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列7）原位ＰＣＲ原位聚合酶链式反应（InStillP

原位PCR的作用

既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH）,但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下,该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列,敏感度很高,但却未能与细胞形态学研究相结合。

ISPCR则可把这两者结合起来,成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。原位PCR的作用操作步骤1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2.PCR扩增细胞内目的片段3.原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达操作步骤A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达8）ＲＴ－ＰＣＲ（逆转录-PCR）组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物或基因特异性的引物（GSP）利用逆转录酶反转录成cDNA.再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达.RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品分析成为可能.该技术主要用于:分析基因的转录产物,获取目的基因,合成cDNA探针,构建RNA高效转录系统.8）ＲＴ－ＰＣＲ（逆转录-PCR）组织或细胞中的总RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增PCR技术概述授课课件9)荧光定量PCR（real-timePCR)

通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。荧光定量PCR仪光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件。9)荧光定量PCR（real-timePCR)荧光定量实时PCR与普通PCR的比较实时在线监控对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物的增加,直观地看到反应的对数期降低反应的非特异性使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了PCR反应的特异性增加定量的精确性全程监控,准确的算法进行定量结果分析更加快捷方便,无需跑胶

荧光定量实时PCR与普通PCR的比较全新4通道实时荧光定量PCR仪

普通梯度PCR仪全新4通道实时荧光定量PCR仪普通梯度PCR仪PCR技术PCR技术

PCR（PolymeraseChainReaction)技术即聚合酶链反应，又称DNA体外扩增技术。

1985年由美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明的一种具有划时代意义的分子生物学技术，被誉为无细胞分子克隆。

PCR（PolymeraseChainReac一、PCR技术的创建Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。

1985年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。

1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术

1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。一、PCR技术的创建Khorana(1971)等提三篇重要论文TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction(ScientificAmerican,1990,262(4):56-61,64-5)Primer-directedEnzymaticAmplificationofDNAwithaThermostableDNAPolymerase(Science,1988,239(4839):487-91

)SpecificSynthesisofDNAInVitroviaaPolymeraseCatalyzedChainReaction(MethodsinEnzymology,1987,155:335-50)

三篇重要论文TheUnusualOriginofth引物引物1983年Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段引物引物1983年Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合94℃变性50-65℃退火XX℃延伸94℃变性50-65℃退火XX℃延伸DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，缺点：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加入。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片

1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。

1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行P1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶IKlenow片段区别，将此酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。

1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thTaq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)40506070809010010080604020TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶二、PCR技术的原理1PCR技术的基本原理在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。二、PCR技术的原理1PCR技术的基本原理在微

体内DNA的复制DNA聚合酶

dNTP解旋酶类引物5’

3’知识点回顾体内DNA的复制DNA聚合酶dNTP解旋酶类加热变性复性复温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA的变性。解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。

加热变性复性复温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以PCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火PCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退2PCR技术的特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍2PCR技术的特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达2302）特异性

引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。引物引物2）特异性引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR3’5’3’5’限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记3’5’3’5’限制性内切酶的识别序列3）操作简便易行

PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。

通常的DNA扩增法是分子克隆法,首先要构建含有目的的基因的载体,然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位素探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。3）操作简便易行PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电目的基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取DNA分子目的基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取DNA分子4）对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用各种生物标本（如血液、体腔液、毛发、细胞、活组织等）粗制的DNA扩增检测。4）对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA5）用途广泛生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学5）用途广泛生命学科三、PCR的反应体系和方法

PCR管加热使模板变性,退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温(72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。三、PCR的反应体系和方法PCR管加热使模板变性,退

总体积50-100l

Buffer

缓冲液

dNTP

原料

Primer

引物

DNA分子

模板

Taq酶

DNA聚合酶

1反应体系总体积PCR技术的基本过程(1)模板DNAdNTP引物Buffer预变性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC2基本过程PCR技术的基本过程(1)模板DNA预变性模板DNATaPCR技术的基本过程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循环仪94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7min循环25～35次PCR技术的基本过程(2)Taq酶循环仪94℃Taq酶7琼脂糖凝胶电泳PCR技术的基本过程(3)琼脂糖凝胶电泳PCR技术的基本过程(3)（1）模板

单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。3PCR反应条件（1）模板3PCR反应条件（2）引物Ⅰ引物合成的质量PCR所用引物质量较高，且需纯化。合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高效液相层析纯化，减少发生非特异扩增和信号强度的降低。冻干引物于-20℃可以保存12-24个月，甚至更长，液体状态-20℃可以保存6个月或更长。

（2）引物Ⅱ引物设计的一般原则（1)引物长度

特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。长度以15-40bp为宜。引物长度增加，能提高特异性，但在退火时被引发的模板会减少，降低反应效率。实际应用中最适延伸温度不要超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃）。Ⅱ引物设计的一般原则（2）引物的3‘末端和5’末端核苷酸

引物3’端为关键碱基，是PCR延伸的起始端，不能进行任何修饰，也不能形成二级结构的可能，一般3‘端也不能发生错配；

5’端无严格限制，只起限定PCR产物长度的作用，对扩增特异性影响不大，可以被修饰。（2）引物的3‘末端和5’末端核苷酸（3）GC的含量

一对引物的GC含量和Tm值应该协调，G+C一般占40-60%。根据公式Tm=4（G+C）+2（A+T）,可估计引物的Tm值。（3）GC的含量（4）两引物间避免有互补序列，尤其避免3’端的互补重叠。一般来讲，引物自身连续互补碱基不能超过3个，一对引物间也不易多于四个连续碱基的互补性。（4）两引物间避免有互补序列，尤其避免3’端的互补重叠。（5）碱基的随机分布

选择缺乏连续单一核苷酸的区域作为引物序列，这样可以减少引物-引物同源互补的机会。也要注意引物在长度和碱基组成上的平衡，两个引物的Tm值相差2-3℃范围内。（5）碱基的随机分布（6）引物内部避免形成二级结构。采用计算机软件可以预测估计mRNA的稳定的二级结构，有助于选择模板。（6）引物内部避免形成二级结构。Ⅲ引物浓度0.1-1mol/L

引物浓度过低，PCR产物量下降。浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降，还会增加引物二聚体的形成。非特异性产物和引物二聚体又可作为PCR反应的底物，与靶序列竞争DNA聚合酶和dNTP底物，使靶序列的扩增量降低。Ⅲ引物浓度0.1-1mol/L（3）循环参数Ⅰ变性的时间与温度

不同的DNA解链温度不同，由于DNA中GC与AT的比例不同引起的。GC比例越大，解链温度越高。一般GC含量每增加1%，解链温度就增加0.4℃。典型的变性条件是95℃30s或97℃15s。（3）循环参数Ⅰ变性的时间与温度过高使聚合酶失去活性，过低DNA变性不完全。变性温度在90-95℃时，既能保证使DNA双链模板变性，又能保持Taq聚合酶活力。因此PCR变性温度在90-95℃之间选择，时间为30-60s。过高使聚合酶失去活性，过低DNA变性不完全。Ⅱ退火时间与温度退火温度决定着PCR的特异性。引物复性所需的温度与时间取决于引物的碱基组成、长度。范围一般在25-65℃，低于引物Tm值5℃

左右。在典型的引物浓度时，退火时间一般为40-90s，过短会导致引物与模板DNA互补配对失败。Ⅱ退火时间与温度退火温度决定着PCR的特异性。Ⅲ延伸时间与温度延伸时间的长短取决于待扩增的模板序列的长度与浓度，以及延伸温度高低。引物延伸在70-74℃下进行，根据扩增DNA的长度而确定，一般延伸30-90s。Ⅲ延伸时间与温度延伸时间的长短取决于待扩增的模板序列的长度与Ⅳ循环次数的确定以既达到扩增效果又尽量减少非特异性产物的扩增为原则，PCR的循环次数一般在25-35次。循环系数过多将增加非特异产物；循环次数太少，产率偏低。因此在得到足够产物的条件下应尽量减少循环次数。Ⅳ循环次数的确定以既达到扩增效果又尽量减少非特异性产物的扩增经典循环参数（500bp以内）94℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃7min4℃forever经典循环参数（500bp以内）94℃30（4）Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus

0.5-2.5U/50l

酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。催化DNA合成的温度以70-80℃为宜。高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。（4）TaqDNA聚合酶（thermusaquaticu（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度，可适当提高Mg2+的用量。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。（6）dNTP

dNTP浓度取决于扩增片段的长度，一般为50-200umol/L;四种dNTP浓度应相等,过高或过低导致错误渗入增加，终止反应；浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量；

dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。（6）dNTP（7）其他辅助试剂加入一定浓度的添加剂如DMSO（二甲基亚砜）、甘油或甲酰胺等，可提高PCR扩增效率及特征性。

可能是消除了引物和模板的二级结构，降低DNA双链的解链温度，使DNA双链完全变性所致。还可加入牛血清白蛋白、明胶、Tween20或二硫苏糖醇（DTT），有助于酶的稳定。（7）其他辅助试剂加入一定浓度的添加剂如DMSO（二甲基亚砜1）不对称PCR

目的：扩增产生特异长度的单链DNA。

方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。

四、PCR的类型1）不对称PCR四、PCR的类型2)反向PCR(reversePCR)

是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。

可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列2)反向PCR(reversePCR)是用反向的已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶3）多重PCR（复合PCR）在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同.

3）多重PCR（复合PCR）在同一PCR反应体系用于检测特定基因序列的存在或缺失。或用于多种病原微生物的同时检测或鉴定，某些遗传病及癌基因的分型鉴定。多种病原微生物的同时检测或鉴定，是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染。

用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物12341234电泳引物123412344）LP-PCR（Labelledprimers)利用同位素、荧光素等对PCR引物5’端进行标记，据此检测目的基因的存在与否.

一次可以同时分析多种基因成分，因而特别适合于大量临床标本的基因诊断。目前该方法只对PCR产物进行定性鉴定。

病毒1病毒2病毒3病毒44）LP-PCR（Labelledprimers)标记引物ＰＣＲ观察PCR产物标记引物ＰＣＲ观察PCR产物5）锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）PCR的局限：需了解靶基因片段两测的序列

对于未知序列和具有不同末端序列怎么办？（固定化PCR）5）锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）PCVHCH1CH1CH2CH2CH3CH3VHVLVLCLCLVHCH1CH1CH2CH2CH3CH3VHVLVLCLCLcDNA末端核酸转移酶3’GG…GG5’CC…CC锚定引物3’GG…GG5’CC…CC3