第二章-海洋生物样品的采集与活性筛选方法

第二章海洋生物样品的采集

与活性筛选方法

1相对与陆地生物样品，海洋生物样品采集和保存更加困难。海洋样品采集困难海洋样品活性成分含量少，药物分析需求量较大。样品保存要求较高2一、海洋生物样品的采集方法1.潜水采集：（采样深度~数十米）

样品主要为海绵、珊瑚、海藻、海星和贝类等。3必须由经过科研潜水培训且具有生物学知识的潜水员或实践经验丰富的渔民来完成。一个大气压人工操作潜水器的应用使采集者可以深入水下1000米采集20世纪90年代，出现遥控潜水装置（非人工）4采样步骤

1

–

准备采集网具采样步骤

2

–

采集水桶、福尔马林、洗涤瓶与采样瓶2.捕捞、拖网采集：海洋鱼类、浮游生物等。

雇佣专门的海洋考察船：大量采集某一特定海洋生物样品

随渔民拖网作业：未设定明确的目标样品，研究者需随船对捕获物进行辨识、捡拾，获得所需样品。

搭乘远洋渔船：仅以收集多种海洋生物样本进行活性筛选为目的5采样步骤

3

–

进行拖网采集作业采样步骤

4

将可能附着的浮游动物冲至网底

6采样步骤

5

将网里附着的浮游动物冲至网底采样步骤

6

将拖网缝隙里的浮游动物冲至网底73.深海潜水器采集：海洋生物密集地、岩石的斜坡、深海底部或峭壁等

目前最深可潜到5000米84.其他采集方式

潮间带或者滩涂的生物一般采用捡拾、挖掘，岸边还可以进行手抛网采集，而一些海洋样品亦可以从当地市场买得。9二、采集样品的具体要求（一）采样工具及试剂1、采样工具铁锹：掘取栖息在泥沙中的动物铁钩子或小铁铲：采集栖息在浅层泥沙中的贝类凿子：凿取栖息在岩石或岩石缝隙内的动物，如牡蛎等冰瓶：保存样品组织捣碎机：制作样品匀浆解剖用不锈钢刀、各类型镊子及剪刀；医用酒精棉球；一次性塑料袋、乳胶手套；广口瓶、聚乙烯袋、纱布、卡尺、记录本、记号笔等。如进行潜水采集，需配备全套潜水器具102、常用试剂

70%乙醇溶液取市售的95%乙醇溶液70ml，加25ml蒸馏水，用于贮存样品

5%甲醛溶液取市售的40%甲醛水溶液12.5ml，加入95ml蒸馏水或海水，用于制作和保存标本碘液

2g碘化钾+1g碘溶于200ml蒸馏水11（二）采样方式采集样品时尽量保持生物个体不受损伤。栖息在岩石或其它附着物上的个体，要用凿子凿取；栖息在沙底或泥底的生物个体可用铲子铲取或铁钩子扒取。贝类样品的采集挑选体长大致相似的个体，若壳上有附着物需去除，彼此相连的个体应分开，现场用海水冲洗干净后，放入双层聚乙烯袋中冷冻保存。藻类样品的采集采集大型藻类样品后用现场海水冲洗干净，放入双层聚乙烯袋中冷冻保存或现场摊晾、晒干后包装。

12

海洋微生物的采集

采自海洋底泥、海水、海洋动植物等→从泥样和水样中分离微生物，从海洋动植物分离附生菌（生物的表面）、内生菌（生物的体内组织）等共生微生物。采集的样品最好立即或尽快进行目的菌的分离，如无条件，则需将样品暂存于4～8℃的低温环境中。分离过程与环境的要求：无菌

一般分离过程:将采集的材料接种到分离介质中培养，然后将生长出的菌落在显微镜下转移到其它培养基中，直至分离到单一菌株。最后选择合适的培养基放大培养。？许多海洋生物体内的共生菌难以在体外培养。

13

海洋活体样品的采集

某些海洋生物仅需研究其分泌物或毒液，采集时应尽量保证能捕捉到活的生物个体，并采用与其栖息环境相似的条件饲养。也可在现场即刻采取毒液等样品，如芋螺毒液的收集。

14三、样品的处置和保存151、样品的编号、采集、记录根据采集样品的安排，对采集后分拣的不同样品进行编号。编号后的样品应选择形状、色泽好的进行拍照。记录样品的一些初步特征。采集原料信息的记录：地理位置、生物的性别和生长阶段等。留出适当的样品作为今后种类鉴定用。162、生物种类鉴定

采集的样品必须确定种属：比对照片、图谱海洋生物分类学专家鉴定样品应留存标本，并注明样品的来源信息。

17大量样品的处理上岸之前进行冷藏处理。上岸后根据样品的情况进行分别处理。绝大多数样品可以进行冷冻处理。不稳定的化合物---特殊处理：冷冻保存、冷冻干燥（干冰贮器或液氮罐，如柳珊瑚中提取前列腺素；保温桶或泡沫塑料箱放入冰块；）

少量样品：密封的聚乙烯袋，与样品标签一起放入另一聚乙烯袋或洁净广口瓶，封口，冷冻保存。3、样品用自来水冲洗

水冲洗是为了减少样品的无机盐和附着的浮游生物等。曾有报道：从样品中分离的化合物有些其实是共生或附生的生物含有

对于成分未知或含肽类易变活性成分的样品18上岸后根据样品的情况进行分别处理。无条件者可用有机溶剂（95％乙醇）浸泡，之后密封入塑料袋或桶中。运回实验室可直接提取活性成分。但对多肽等遇有机溶剂变性的样品不适合。海藻等可以晒干或者晾干保存：会损失部分有效成分，采集量要大。活体饲养：采集后应营造与生物个体生存环境相近的条件进行饲养，并尽早运回实验室。194、样品的实验室处理采集到的大量样品浸泡于酒精中，如果时间允许，应尽快提取进行成分分析。样品浸泡时间不宜过长，防止样品中的化学物质发生变化。样品储存应该尽量保持低温，防止样品腐烂。海藻等样品也要注意防虫、防腐、防霉等处理。夏威夷大学在研究箱鱼毒素时，曾采用巧妙的方法，箱鱼捕捉后立即放入已经准备好的蒸馏水中，由于环境发生变化箱鱼排出毒素，然后将含毒素的蒸馏水用丁醇提取浓缩后经纯化得到。20四、样品的活性筛选（一）活性筛选发展的三个阶段1、有目的地寻找某类已知的活性化合物及其类似物——测定不同生物中感兴趣的化合物的含量；活性测定方法仅作为研究手段。2、寻找具有某种生物活性的物质，一般是未知物——采用某一筛选模型对大量样品进行广泛筛选，在确定样品具有活性后再开展深入研究。目前多数研究处于这一阶段3、高通量（HTS）筛选——采用多种药理模型，在分子、受体水平上对大量样品进行快速、高效、低成本的活性筛选。21

根据所选材料、药物作用对象以及操作特点的不同，可以将活性筛选模型分为三类：整体动物水平模型与传统筛选程序理想的动物模型应具备的基本条件：病理机制与人类疾病的相似性、病理表现的稳定性和药物作用的可观察性。

优点：可从整体水平直观地反映药物的治疗作用、不良反应以及毒性作用。临床试验不可或缺的前提。

缺点：依赖手工操作、样品量大、病理模型太少。局限性、低效率、高成本（二）活性筛选模型的分类22组织器官水平模型和体外药物筛选方法

优点：通过观察活性成分对特定组织或器官的作用，可以有效地观察药物的作用原理和可能具有的药理作用——降低筛选样品的用量和动物用量；提高筛选效率，降低筛选成本；减少了影响药物作用的因素，易于评价药物作用。

缺点：规模小、效率低、反映药物作用有限、样品需要量大、不易实现一药多筛、人工操作技术要求高。离体血管实验，心脏灌流实验、组织培养实验等23细胞、分子水平模型和高通量药物筛选

以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整个体系运转的技术体系。优点：材料用量少、作用机制比较明显、可大规模进行筛选，效率高。

缺点：离体实验，可能造成假相。24

有机相提取体系海洋生物原料+有机溶剂→浸提→过滤或离心→减压浓缩→浓缩液→有机溶剂→二次提取→喷雾干燥→粗品

水相

↓粗品干燥回收溶剂轻相液液萃取

喷雾干燥←液膜浓缩重相柱层析体系——纯化海洋生物原料→浸提→过滤或离心→减压浓缩→浓缩液→溶解→微孔过滤超滤→柱层析→分部收集组分→浓缩→冷冻干燥→目标成分水相提取体系海洋生物原料+水→浸提→过滤或离心→减压浓缩→浓缩液→喷雾干燥→粗品└→液液萃取→有机相粗品←喷雾干燥←浓缩←水相（三）样品处理和活性筛选流程2526海洋微生物活性物质的筛选与研究流程27（四）常用的活性筛选方法生物活性的筛选方法各式各样，筛选效率直接与实验的设计有关，靶标越明确，越有可能获得特定活性的产物，因此如果对病理和药理方面有越深入越具体的了解，就越有利于筛选。常用的活性筛选方法包括以下几种：281.抗菌活性筛选---抗生素的研究抗菌活性筛选是目前应用非常广泛的活性筛选方法之一，特别在药用微生物和抗生素的筛选上，本方法起到了举足轻重的作用。抗菌活性主要包括抗细菌、抗真菌、抗支原体活性的筛选。29据世界卫生组织（WHO）规定的标准方法，即Bauer-Kirby纸片法进行药效测定。初筛菌株包括：金黄色葡萄球菌（G＋）、藤黄八迭球菌（G＋）、大肠杆菌（G－）、绿脓杆菌(G－)等。深入研究的试验菌株有以上细菌的耐药株和临床株。（1）抗一般细菌药物筛选30厌氧菌（Anaerobic）是一类对游离氧敏感的微生物，生长需要一定的厌氧环境，目前对抗厌氧菌药物筛选尚无一种公认的标准方法。微量液体稀释法(BrothMicro-DilutionMethod)

：筛选抗变形链球菌（龋齿的主要病原菌）药物；琼脂稀释法(AgarDilutionMethod)：筛选抗幽门螺杆菌（胃及十二指肠溃疡的致病菌）药物。(2)抗厌氧细菌药物筛选可在一个平板上同时作多株菌MIC测定微量液体稀释法：培养基：Mueller-HintonBroth(组成肉浸膏300g/柠檬酸17.5g/淀粉1.5g/蒸馏水1000ml），灭菌后，25℃水浴中调节pH7.1-7.4,在配制好的培养基中加入Ca2+和Mg2+各25mg/L;

操作：选择U字形微量板进行试验，每孔中加入约0.1ml含样品的上述培养基，用专用盖密封后，在-60℃下保存，有效期可以维持3个月左右，抗菌药物的溶解与稀释需用蒸馏水和上述培养基；接种菌量最终达到每孔104cuf;一般在5±1℃的条件下培养18-24小时；结果判定：确认用于对照的未添加药物的培养基中有细菌生长后，将肉眼观察到没有细菌生长的培养孔中的药物浓度定为MIC。31

真菌是高级进化的微生物，种类多，生长发育过程复杂，其菌体可分化成菌丝型和酵母型，对药物的敏感性不同。在新药筛选时，除用纸片法或琼脂稀释法测定药效、测量抑菌圈范围外，还要仔细观察被测物质是否阻止分生孢子萌发，抑制菌丝生长扩散，或造成菌丝畸形等。初筛真菌有：白色假丝酵母（酵母型）和红色毛癣菌（菌丝型）。(3)抗真菌药物筛选常用32支原体（Mycoplasma）是界于病毒和细菌之间没有细胞壁的微生物，广泛分布于自然界，能引起人类和动植物的感染以及各种组织细胞培养的污染。支原体能在特殊的培养条件下生长繁殖，引起pH值变化，故采用颜色改变单位（ColorChangeUnit,CCU）检定其生长状况。当被测物质发挥生长抑制效应或杀灭支原体时，含有指示剂的培养基不再变色，据此判断药效。初筛的试验菌株有溶脲支原体（人体致病菌，细胞株污染）和人型支原体（人体常见株，条件致病，细胞株污染）。(4)抗支原体药物筛选332.对动物影响活性的模型环节动物、鲍鱼以及咸水虾的幼体可用于检测样品对动物的毒性或其他影响。通常多个幼体置于样品液中，然后观察对致死性或对变态过程、定殖效果、虫室形成等方面的影响。（1）对动物幼体的定殖或变态的抑制34（2）对无脊椎动物运动的影响：在加有样品的溶液中，如果一个饲养着的水螅或者其他动物总保持收缩状态，可以认为遇到有毒的代谢物。（3）金鱼毒性试验：样品对小金鱼的影响，可表现为致死或者失去平衡等。（4）通过器官和生理系统检测：可检测心脏、血压和肌肉等的作用活性。35海虾卵的孵化：取海虾卵100mg置于500mL烧杯中，加入人工海水400mL，用一小充气泵缓缓充气，室温孵化24小时，除去卵壳及未孵化的卵，海虾幼虫继续培养24小时，备用。海虾生物致死法：取96孔细胞培养板，每孔加100µL，含10-15个海虾幼虫的人工海水液，制成测试培养板。空白对照组和每个浓度的样品组各设三个平行孔，空白对照组加100µL人工海水，样品组加100µL所需浓度的样品液。测试样品设置终浓度为50µg/mL。室温培养24小时后，在双目解剖镜下检测计数海虾死亡个体数目。

海虾死亡率＝[(原始数目-存活数目)/原始数目]×100％举例：海虾生物致死法(初筛)

363、细胞水平筛选（1）抗肿瘤药物筛选：利用小鼠白血病细胞和多种来源清楚、病理分型明确且对药物敏感的人恶性肿瘤细胞株，在细胞培养板上观察被测物质在体外对肿瘤细胞的生长抑制或杀伤作用；（2）采用四氮唑盐酶还原法（Microculture

Tetrozolium,MTT）或磺酰罗丹明B法（Sulfor

RodamineB，SRB）测定化合物对肿瘤细胞的生物效应。37MTT法：按细胞生长速率，将一定数量处于对数生长期的细胞90µL/孔接种于96孔微量培养板内，培养24h后每孔加入待测样10µL，每个细胞株，每个浓度均为三个复孔。细胞在37℃、5%CO2条件下培养48h后，每孔加用生理盐水配制的5mg/mLMTT（四氮唑盐酶）液20µL；继续培养4小时后，每孔加入三联液(10%SDS-5%异丁醇-0.01mol/LHCl)50µL，于CO2培养箱中过夜。然后用酶标仪在最适合波长570nm测每孔OD值。按下列公式计算待测样对细胞抑制的影响。细胞抑制率%=((对照组OD值-加药组OD值)/对照组OD值×100抗肿瘤细胞株活性筛选的方法38（3）常用细胞株：P388（小鼠白血病细胞）、A-549（人肺腺癌）、

HL-60（人急性早幼粒白血病）、BEL-7404（人肝细胞性肝癌）、人肺腺癌细胞株(SPC-A4)、人胃癌细胞株(MKN-28)、人大肠癌细胞株(HCT-116)、人浆液性卵巢腺癌细胞株(HO-8910)、人单核细胞白血病细胞株(U93)、人卵巢癌细胞株(3AO)、小鼠移植性肿瘤S180肉瘤、H22肝癌、U14宫颈癌、Lewis肺癌、EMT6乳腺癌等。肺癌间质中的巨噬细胞有望成为肿瘤治疗的新靶点394、酶抑制剂筛选法多种疾病是因为特定酶的活性增强或者减弱而引起，以该酶为靶标筛选抑制剂或激动剂，将大大增加获得适用代谢物的可能性。应用酶抑制剂（激动剂）筛选法，可以获得具有抗肿瘤、抗血栓、抗糖尿病、抗病毒、抗炎以及降血脂、降血压等活性的药物。40抗肿瘤活性的筛选靶酶DNA拓扑异构酶Ⅱ：芳香酶：法尼基转移酶：蛋白激酶等：

靶酶的种类抗血栓形成活性的筛选靶酶：凝血酶、血小板活化因子酰基转移酶等。41⑤抗炎活性的筛选靶酶：溶磷脂酶、磷脂酶A2、脂氨酶抗神经退化活性的筛选靶酶：乙酰胆碱脂酶。降血脂活性的筛选靶酶：鲨烯合成酶、胆酰辅酶A、胆固醇酰转移酶（A-CAT）、β-羟基-β-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）等降血压活性的筛选靶酶：肾上腺素合成酶、内皮素转换酶③抗病毒活性的筛选靶酶：蛋白酶、与复制有关的酶。④

抗糖尿病活性的筛选靶酶：醛糖还原酶需同时筛选对丁酰胆碱酯酶不抑制的活性425、受体拮抗活性筛选受体是指生物体内与配体相结合的大分子化合物的结合位点。这些大分子化合物主要有细胞膜和细胞内的蛋白质、核酸、脂质等。原理：每一生化反应系统都有严密的机制进行调控，信号分子往往需要与受体分子结合而启动生理、生化过程。如样品能够与受体结合，则会与正常信号分子产生竞争从而抑制该生化过程。43用于抗肿瘤活性筛选的受体：非甾类雌激素受体、雄激素受体等用于抗血栓活性筛选的受体：纤维蛋白原受体用于降血压活性筛选的受体：内皮素受体、血管紧张素Ⅱ受体。

常用的活性筛选的受体446免疫调节活性代谢物的筛选法T细胞和B细胞是两类重要的免疫活性细胞，前者主要介导细胞免疫功能，后者主要负责抗体生成。使其增殖能力加强的药物可用于免疫功能低下性疾病，如肿瘤、感染及衰老等。抑制其过度增殖的药物可用于某些自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等，同时也能降低器官移植后的排异反应。457抗病毒药物的活性筛选通过体外抗病毒实验和体内抗病毒药效得出样品细胞毒性、细胞内抗病毒作用（如以细胞致病效应及感染细胞保护率为指标）和体内抗病毒药效。

直接杀伤

抑制病毒与细胞吸附：如多糖抑制逆转录酶、蛋白酶、整合酶活性免疫：增强淋巴细胞、NK细胞等的杀伤能力46

8其他筛选

其他如神经系统药物、抗炎、心血管疾病药物、抗氧化等筛选均是采取离体实验（离体的细胞、组织和器官等病理模型）和在体实验（病理动物模型）进行多方法、多指标结合的筛选。根据筛选内容的不同在不同筛选方法上各有侧重。47（五）现代筛选技术简介高通量筛选（HTS

）技术虚拟药物筛选（Virtualscreening）技术高内涵筛选（HCS）技术48Ⅰ高通量筛选技术(HTS)

高通量筛选技术(Highthroughputscreening，HTS)

：

是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整个体系运转的技术体系。4950人工合成：需要化合物的提取分离和结构鉴定两种技术的支持。常规化学合成组合化学合成天然产物：母核结构和活性基团是长期自然选择的结果，具有活性优越性1高通量筛选技术体系的组成

（1）生物样品库及化合物样品库

？我国的天然产物单体成为各国的热点

一门将化学合成、组合理论、计算机辅助设计及机器人结合为一体的技术。根据组合原理在短时间内将不同构建模块以共价键系统地、反复地进行连接，从而产生大批的分子多样性群体，形成化合物库；然后，运用组合原理，以巧妙的手段对化合物库进行筛选、优化，得到可能的有目标性能的化合物结构的科学

化合物库的制备、库成分的检测及目标化合物的筛选三个步骤

51

信息库名称提供的单位国家信息量其他

NapralertCollegeofPharmacy,美国＞114000条海洋与CA在线

UniversityofIllinois;陆地生物及微生物注册链接

STNInternational

Marinlit

M.H.G.Munro,J.W.新西兰＞5000条海洋生物可购买

Blunt,UniversityofCanterburyMarineNaturalD.J.Faulkner,University

美国＞4500条海洋生物可购买

ProductsofCalifor

nia,Scripps

DataBaseInstituteofOceanography重要的化合物信息库52利用计算机通过操作软件控制整个实验过程。操作软件采用实物图像代表实验用具，简洁明了的图示代表机器的动作。自动化操作系统的工作能力取决于系统的组分，根据需要可配置加样、冲洗、温解、离心等设备以进行相应的工作。（2）自动化的操作系统微孔板为反应容器；条形码标记不同的微孔板；光电阅读器对特定的微孔板上的特定位置进行操作；存贮操作结果及数据53自动化的加样方式是决定筛选速度的重要因素。目前主要有单孔、8孔、96孔、384孔等几种方式。单孔一般用于对照样品以及复筛中零散样品的转移。96孔、384孔在酶活性检测以及需同时开始和终止反应的筛选模型中是必需的。自动化操作系统的一个重要组成部分是堆栈(hotel)。堆栈是指在操作过程中用来放置样品板、反应板以及对它们进行转移所需的腾挪空间。自动化操作系统由计算机及其操作软件、自动化加样设备、温孵离心等设备、堆栈4个部分组成。决定样品数量54

（3）高灵敏度的检测系统液闪计数器：样品与靶分子反应后在闪烁液中引起闪烁，把核辐射能转换成光子。亲和闪烁分析：通过亲和结合，将放射配基（目标化合物）结合到具有受体（靶分子）的闪烁球上，从而产生光子被检测。此法减少放射配体标记分析中的游离配基与结合配基的分离过程，使得放射配基分析可以以全自动的方式进行。基于放射性的方法多是将底物标记，测定放射性产物的生成。在细胞表面受体药物筛选中应用较为普遍55实例基于放射性而无需过滤分离的SPA的应用

Brown等建立了内源性肽酶的水解活性检测方法，用以研究其抑制剂。用3Ｈ标记的肽底物，通过生物素(biotin)与抗生物素蛋白(avidin)包裹的SPA闪烁球相连。酶解使3Ｈ随肽的断裂而离开闪烁球。测定3Ｈ放射性作用于闪烁球产生的闪烁信号的丢失量，即指示酶活性大小。

56分光光度法与宽谱带分光光度仪：如DAD在HTS技术中，通过计算机接口实现对多孔板的同时检测。化学发光检测计数器：荧光素酶报告基因分析实验荧光光度仪：可在短时间内同时测定荧光的强度和变化，对测定细胞内钙离子流、钠离子流及测定细胞内pH等，是非常理想的一种高效检测方法。灵敏度高57

（4）数据库管理系统

数据库管理系统承担4个方面的功能：样品库的管理功能；生物活性信息的管理功能；对高通量药物筛选的服务功能；药物设计与药物发现功能。58

2高通量筛选模型

常用的筛选模型都在分子水平和细胞水平，观察的是药物与分子靶点的相互作用，能够直接认识药物的基本作用机制。59（1）分子水平的药物筛选模型

包括受体筛选模型；酶筛选模型；离子通道筛选模型。

1.1受体筛选模型：指受体与放射性配体结合模型。以受体为作用靶的筛选方法，包括检测功能反应、第二信使生成和标记配体与受体相互作用等不同类型。检测方法——报告基因60

1.2酶筛选模型：以酶为作用靶的高通量筛选方法，绝大多数是直接检测酶活性，观察药物对酶活性的影响。具体方法根据酶的不同而不同，主要有基于放射性的方法和基于比色、荧光的方法两大类。

根据酶的特点，酶的反应底物，产物都可以作为检测指标，并由此确定反应速度。典型的酶筛选包括：(1)适当缓冲液中孵化；(2)控制反应速度，如：温度，缓冲液的pH值和酶的浓度等；(3)单时间点数器，需测量产物的增加和底物的减少。61实例将酶标记测定被特异结合的酶的方法。Vollmer等建立了一种以青霉素结合蛋白(PBP)为靶的抗生素的高通量筛选方法。PBP既是糖基转移酶又是肽转移酶，该法是筛选其糖基转移结构域的活性位点上的可结合物。将莫诺霉素(moenomycin)结合于一种小球上，制成混悬液，加入96孔板，然后加入3Ｈ标记的PBP(细菌膜粗提物)和受试化合物，孵育、过滤去掉非结合的放射性，闪烁计数测得的放射性指示PBP与莫诺霉素结合的情况及受试化合物对其影响。

62细胞离子通道(蛋白)是细胞膜上的一类特殊亲水性蛋白质微孔道，它的结构和功能正常是维持生命过程的基础，是神经、肌肉细胞信号传导的基本元件。离子通道的主要类型有钾、钠、钙、氯和非选择性阳离子通道等。1.3离子通道筛选模型

63

ⅰ贝类动物毒素的高通量筛选：其作用靶为Na+通道上的蛤蚌毒素结合位点，用放射性配体(3H-STX)进行竞争性结合试验考察受试样品的功效。ⅱ

酵母双杂交的方法高通量筛选：筛选干扰N型Ca2+通道的小分子，寻找新型Ca2+通道拮抗剂。离子通道病：指离子通道的结构或功能异常所引起的疾病。某一疾病或药物引起某一种或几种离子通道的数目、功能甚至结构变化，导致机体发生或纠正某些病理改变。64（2）细胞水平药物筛选模型

观察被筛样品对细胞的作用，但不能反映药物作用的具体途径和靶标，仅反映药物对细胞生长等过程的综合作用。包括：内皮细胞激活；细胞凋亡；抗肿瘤活性；转录调控检测；信号转导通路；细菌蛋白分泌；细菌生长。65（4）影响HTS的因素HITS=[compounds][assays][diversity]：发现先导化合物的机会[compounds]：数量、种类[assays]：检测方法、药理模型、靶标[diversity]：多样性高通量筛选的基础66（5）高通量筛选技术的优点快速—每天筛选数万药次；微量—筛选样品需要量为微克级；灵敏—准确判断筛选样品的活性和选择性；经济—筛选费用低；67（6）局限性

高通量筛选作为药物筛选的一种方法，并不是一种万能的手段，特别是在中药研究方面，其局限性也是十分明显的。首先，高通量筛选所采用的主要是分子、细胞水平的体外实验模型，因此任何模型都不可能充分反映药物的全面药理作用；其次，用于高通量筛选的模型是有限的，要建立反映机体全部生理机能或药物对整个机体作用的理想模型，也是不现实的。68虽然其发现活性化合物的速度快，但是其检测模型均建立在单个药物作用靶分子的基础上，无法全面反映被筛样品的生物活性特征，只得到有限的数据，初筛得到的阳性结果需要进一步确认。69Ⅱ虚拟药物筛选（virtualscreening）定义：针对重要疾病特定靶标生物大分子的三维结构或定量构效关系(QSAR)模型，从现有小分子数据库中，搜寻与靶标生物大分子结合或符合QSAR模型的化合物，进行实验筛选研究。虚拟筛选目的：发现有苗头的化合物，集中目标，降低实验筛选化合物数量，缩短研究周期，节约研究经费。组成：虚拟药物筛选应用软件，理论方法，研究对象，操作过程，结果分析评价。70始于上世纪60年代，应用于创新药物先导结构的发现和优化并取得突破性进展始于80年代中期。主要推动力有三方面：分子生物学和结构生物学的发展，使得一些靶标生物大分子的功能被阐明，三维结构被测定；计算机科学的发展，出现了功能先进的图形工作站，极大地提高了计算和数据分析的速度和精度；许多药物分子设计新方法快速发展，如基于生物大分子三维结构的分子对接(moleculardocking)方法和基于药物小分子的三维定量构效关系分析方法和数据库搜寻方法等。1虚拟药物筛选历史71分子对接(moleculardocking)示意图72即基于小分子的药物设计(ligand-baseddrugdesign,LBDD)：根据现有药物的结构、理化性质与活性关系(SAR)的分析，建立定量构效关系(QSAR)或药效基团(pharmacophore)模型，预测新化合物的活性；2药物设计方法分类：两类

73基于受体生物大分子结构的药物设计(structure-baseddrugdesign,SBDD）:根据受体生物大分子(蛋白质、核酸等)的三维结构（晶体结构、核磁共振(NMR)结构、低温电镜结构或计算机模拟结构）用理论计算和分子模拟方法建立小分子－受体复合物的三维结构，预测小分子－受体的相互作用，在此基础上设计与受体结合(活性)口袋互补的新分子。74(1)收集文献上发表的小分子化合物结构的信息，组成二维(2D)小分子数据库。对每个小分子进行原子类型和化学键归属，将2D结构转变成三维(3D)结构并进行结构优化，组成3D小分子数据库；(2)对生物大分子(蛋白质)进行质子化和原子电荷归属，并进行结构优化，确定小分子结合位点，构建计算网格；(3)将3D小分子数据库中的每个化合物对接到生物大分子的活性位点，并进行打分——计算小分子－生物大分子的结合强度Ki(结合自由能)；(4)根据打分的结果挑选化合物(打分比较高的分子)，进行类药性评价，选择化合物进行生物实验测试。3基于分子对接的虚拟筛选的过程754虚拟筛选的意义提高了筛选化合物的速度和效率，缩短新药研究的周期。目前药物研究的靶标大约500个左右；10年后可能达到1000个以上的新靶点。现有的有机小分子(天然产物和合成化合物)大约有2000万。76775我国虚拟筛选的研究现状目前全国已有80余家院校和研究机构建立了药物设计(包括农药设计)研究部门，从事药物设计的课题组有100多个，这些研究机构均建立了一定规模的药物设计(虚拟筛选)平台。有些研究机构(如中国科学院上海药物研究所药物发现与设计中心、北京大学物理化学研究所、军事医学科学院毒物药物研究所药物设计实验室、中国科学院上海有机化学研究所计算机化学实验室、华东理工大学药物化工研究所、南开大学农药工程中心等)形成了以药物(包括农药)设计为特色的研究方向，在国内外产生了重要影响。78最近，中国科学院上海药物研究所与上海交通大学、江南计算技术研究所等单位合作，在上述药物设计平台的基础上建立了“新药研发应用网格”技术平台，将网格技术应用于虚拟筛选，现已将上海、北京和香港地区的多个超级计算机和计算机集群等计算资源加入到网格平台，形成了每秒超过万亿次浮点运算能力，大大提高了虚拟筛选的速度，在将来的药物设计中将发挥重要作用。796虚拟筛选的最新进展（1）应用于基因功能的研究----化学生物学(chemicalbiology）根据基因组研究结果，可以用虚拟筛选方法在较短的时间内发现特定基因调控网络中涉及到的某些蛋白质的抑制(或激活)剂，用于基因功能的确证。80（2）寻找新靶标以活性小分子(天然产物或现有药物)为探针，用虚拟筛选的方法搜寻蛋白质结构数据库，发现活性小分子的结合蛋白，以此为线索发现药物作用新靶标。李洪林与岳建民合作发现了具有抗幽门螺旋杆菌活性天然产物的作用靶标－PDF蛋白81（3）发现老药的新药理作用

2003年，SARS爆发期间根据SARS冠状病毒(SARS-CoV)蛋白水解酶(Mpro)的同源蛋白模拟结构，用SBVS方法虚拟筛选了现有药物库，从中发现具有抗精神分裂和抗炎作用的老药肉桂硫胺是SARS-CoV

Mpro

的抑制剂，酶水平抑制活性IC50

为5.0μM，能明显抑制病毒颗粒的复制，细胞水平(MTT测试结果)抑制SARS-