生物质谱在蛋白质组学研究中应用

生物质谱在蛋白质组学争辩中应用主要内容：

张养军钱小红军事医学科学院放射与辐射医学争辩所北京蛋白质组争辩中心一、蛋白质组学进展简介二、蛋白质组争辩意义三、蛋白质组学争辩的内容四、蛋白质组争辩中的简单性五、蛋白质组学争辩的主要争辩策略六、生物质谱在蛋白质组学争辩中的应用七、蛋白质组学争辩中的主要技术挑战一、蛋白质组学进展简介蛋白质组〔proteome：一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的全套蛋白质。蛋白质组学〔proteomics)：争辩细胞、组织或生物体中蛋白质组成、定位、变化及其相互作用规律的科学。简要历史回忆：1994年，澳大利亚的科学家首次提出蛋白质组概念；1995年，蛋白质组一词首次见诸报端；20224月，在美国成立了国际人类蛋白质组争辩组织(HumanProteomeOrganization,HUPO)，随后欧洲、亚太地区都成立了区域性蛋白质组争辩组织，试图通过合作的方式，融合各方面的力气，完成人类蛋白质组打算(HumanProteomeProject)；另外，除了相关期刊外，创刊了蛋白质组学特地杂志，如《ProteomicsMolecular&cellularproteomics》和《Journalofproteomeresearch2022年～HUPO国际会议和四届中国蛋白质组学术大会。二、蛋白质组争辩的意义1、一些物种如小鼠、大鼠等基因组测序工作的完成，特别是人类基因组打算草图完成〔2022年，为蛋白质组打算的实施奠定了根底。蛋白质组的争辩不仅是基因组争辩的深入和连续，更重要的是要答复在基因组和转录组水平上无法答复的生物学问题，比方它们之间的连锁关系以及功能网络等。2、作为生命功能的执行体——蛋白质组的争辩是为了从更高层次上深入解读生命的本质和生命活动的规律。3、为人类疾病的病理争辩、早期诊断、治疗以及药物开发供给依据。三、蛋白质组学争辩的内容1、蛋白质组表达谱〔proteomeexpressionprofiling〕针对已有基因组或转录组数据库的生物体、组织或细胞，建立相应蛋白质组或亚蛋白质组数据库。如：Humanplasmaproteomeproject；Humanliverproteomeproject。2、蛋白质组修饰谱(proteomemodificationprofiling)建立生命功能执行和调控网络相关的蛋白质翻译后修饰数据库。3、根本生物学问题争辩与生命活动过程中亲热相关的问题。比方：Post-translationalmodification；Protein-proteininteraction；Genome-Transcriptome-Proteome。4、临床应用问题以重要的生命过程或人类一些重大疾病为对象，进展重要的生理和病理体系或过程的争辩，即进展比较蛋白质组学争辩。比方：Diseasemarker-diagnosisMechanismofthediseaseDrugtarget-therapy5、蛋白质组学中的技术和方法建立蛋白质组学支撑技术平台以及生物信息学争辩工具。四、蛋白质组争辩中的简单性一种细胞、组织或生物体有多少蛋白质?3～4万个基因，仅是果蝇或线虫的两倍左右。人体：1个受精卵 1012细胞，103细胞类型。其“蛋白质组”随“时”、“空”处于变化之中，而“基因组”则处于永恒于之中。生命体的统一性源于基因组生命体的简单性基于蛋白质组五、主要争辩策略1、争辩根底生物学的进展，特别是基因组测序的完成为我们供给了蛋白质组数据库；生物质谱和分别科学的进步为我们供给了分别和鉴定的必需手段；计算机技术的提高，特别是生物信息学的进展为我们处理海量数据供给了有力的支持。2、蛋白质组学争辩方法分类蛋白质定性分析为自下向上法〔bottomup,针对多肽混合物〕和自上向下法(topdown，针对整体蛋白质混合物)。依据蛋白质数据库中是否存在所鉴定的蛋白质，蛋白质组的定性分析方法进一步分为：对蛋白质数据库中含有待鉴定的蛋白质，包括:肽质量指纹谱法〔PMF，适合于简洁蛋白质混合物);肽序列标签法〔PST，适合于简单蛋白质混合物〕对蛋白质数据库中不存在待鉴定的蛋白质，承受从头测序法〔denovo〕蛋白质组相对定量分析方法①直接进展比较，包括SDS-、2DE、HPLC；②标记方法，包括同位素标记亲和标签〔ICT、元素标记亲和标签〔ECT同位素氨基酸细胞培育标记(SILAC)和DYGE技术；18O标记。3蛋白质组争辩方法进展(1)简单蛋白质组体系方法。〔2〕简洁的蛋白质组体系对于特定的、简洁的蛋白质组分析，既可承受多维分别技术与质谱联用的方法，也可以3所示。六、生物质谱在蛋白质组学争辩中的应用1、表达谱构建2、修饰谱构建3、蛋白质组定量1、表达谱构建(1)2DE-MALDI-TOF/TOFMS技术平台2DE-MALDI-TOF/TOFMS技术路线具有分别效率高、直观和相对定量的特点，被广泛蛋白质组和成人肝脏蛋白质组等组织和细胞系蛋白质组的争辩。2DE-MALDI-TOF/TOFMS技术平台技术路线特点：成功率(考染):90%zoomMALDI-TOF/TOFMS联用为了获得更高的分别度，呈现更多的蛋白质点，承受ZOOM胶技术是一个重要的选择，MALDI-TOF/TOFMS的联用，可鉴定更多的蛋白质点。2-DE表达谱共鉴定：601，唯一蛋白质:330〔2〕多维分别-质谱分析技术平台构建作为2DE-MS技术平台的重要补充，多维分别技术路线已经受到人们的高度重视。多比，由于蛋白质或多肽的理化性质〔分子量、等电点和疏水性等〕的显著差异，使其在色谱柱中的传质速率和容量因子相差较大，所以在对其进展分别时，一般承受梯度洗脱，且色谱峰较宽。整体蛋白质分别方法选择依据：依据分子外形和大小，如超滤、体积排阻等；依据分子密度性质，如蔗糖梯度密度离心技术；依据分子等电点不同，如离子交换、色谱聚焦、等电聚焦；依据分子疏水性不同，如反相色谱、疏水色谱；依据亲和性不同，如亲和色谱；IMAC方法对磷酸化肽段提取；依据特别化学反响基团，如巯基填料选择性富集含巯基的肽段。液相色谱-质谱联用方法用于严峻急性呼吸系统综合征冠状病毒构造蛋白质的争辩20225Genebank11株，其中包括由军事医学科学院微生物流行病争辩所和中国科学院基因组争辩所提交的BJ01病毒株的全基因组序列。SARS-CoV〔BJ01〕基因组SARS-CoV(BJ01)蛋白质的理化性质争辩意义SARS冠状病毒基因组序列的测定为SARS解、修饰与定位、转运。争辩目的承受蛋白质组学的策略，通过系统争辩SARSBJ01株的自然构造蛋白质，全面验证基因组与生物信息学推想的SARSSARSSARS早期诊断及药物筛选的靶标、研制有效的治疗药物供给根底。N蛋白质肽序列检索结果S蛋白质肽序列检索结果蛋白质肽序列检索结果蛋白质肽序列检索结果N蛋白质分子量Theoretical:45935DaMeasured: Difference:0.13/1000MALDI-MSN蛋白质分子量N蛋白降解片段完整N蛋白SARS-CoVVeroE6HPLC小结1SARSCoVVeroE6细胞提取液中成功鉴定出S、NMM蛋白首次在蛋白质水平鉴定出来；2N蛋白的相对分子质量，证明其氨基末端的第一个氨基酸-丝氨酸发生乙酰化修饰，提示不存在理论推测的磷酸化修饰；3、通过比较说明两种方法在蛋白质组学争辩中各具优缺点，可依据不同目的选择使用。胎肝线粒体蛋白质制备(2%2～3g/10ml)〔120220g,90min〕〔8Murea,65mMDTT,40mMTris〕提取全蛋白质，25000g离心并过滤后，进一步进展整体蛋白质分别。用ProteomLabPF2D色谱仪对胎肝线粒体提取液进展二维色谱分别示意图对胎肝线粒体全蛋白提取液的一维色谱分别一M2B3馏分的反相色谱分别图4.6mmI.d.35mm,C18,1.5μm;0.5ml/min;检测波长214nm；溶剂梯度：0～100％B,60min，100％B保持8min，1.0min回到100％A平衡色谱系统；每2min。整体蛋白混合物二维色谱分别试验结果：一维色谱聚焦:40个馏分〔0.3pH或5min〕二维反相色谱:20个馏分〔1.0min〕总计:800个馏分。M2C8_21MicroLC-ESI-IonTrapMS12.90min时的一级质谱图SEQUEST处理的结果判据：电荷为+1时，Xcorr2.0；电荷为+2时，Xcorr2.2；电荷为+3时，Xcorr3.5；△Cn≥0.123个连续的yb序列NanoLC-ESI-Q/TOFMSM2B3_18NanoLC-ESI-Q/TOFMS一级质谱总离子流色谱图M2B3_18NanoLC-ESI-Q/TOFMS二级质谱四通道总离子流色谱图M2B3_18m/z795肽段的NanoLC-ESI-Q/TOFMS二级质谱的质谱图MASCOT对数据进展检索结论478个胎肝蛋白质，Q/TOF319797个胎肝蛋白质，其中确定的线粒体蛋白质接近20%，在国内外人胎肝线粒体蛋白质组表达谱构建中首次分别鉴如此之多的蛋白质，说明试验设计和技术路线是可行的；二、试验中觉察蛋白质的疏水性、pI值、样品缓冲液以及数据库的选择等都会对最终的检出结果有影响，因此在进展试验及结果处理时值得留意。反相色谱－SDS--串联质谱分析技术样本制备方法：停2s，60 次)溶解后，离心分离〔15000g，40min〕，取上清备用。反相色谱分别人肝脏蛋白质混合物色谱图A,1次制备；B32次制备色谱条件：150mm×4.6mmi.d.,C8，5m，30nm;流速：0.75mL/min;检测波长：214nm；非线性溶剂梯度：100%A(5% aqueousacetonitrileplus0.1%TFA)～10%B(95%aqueousacetonitrileplus 0.1%TFA),10min;10%B～35%B,10min;35%B～75%B,40min; 75%B～100%B，8min;100%B，5min100％B~100%A,3min;平衡32min后进展下一次分别。90中第24条蛋白质带的总离子流色谱图〔、相应的一级质谱图〔B〕m/z：809离子的串联质谱图〔C〕试验结果和争辩474个多肽混合物。按上述96962552402240个蛋白质簇。pI的分布不同蛋白质随分子量的分布不同蛋白质随疏水性参数的分布结论通过RPLC-SDS-与纳升毛细管液相色谱－串联质谱联用技术对人肝脏蛋白质组表达谱的构建及其理化性质的统计分析，说明该技术路线兼顾了反相色谱分别度高和SDS-组的争辩。全程自动化的固相金属亲和色谱－反相液相色谱－串联质谱磷酸化蛋白质分析技术IMAC毛细管亲和色谱柱的制备—两通固定滤膜筛板制作法及柱装填技术1，两通阀 2，毛细管色谱柱3，过滤膜 4，连接毛细管5，加样枪 6，刃环和空心螺母7，匀浆管 8，高压恒流泵9，旋涡混合器100μm20μm粒径的亲和色谱填料IMAC-RPHPLC-MSMS分析平台IMAC-RPHPLC-MSMS分析平台的测试和优化IMAC柱对磷酸肽吸附的选择性洗脱液类型对质谱结果的影响Washbuffer对亲和选择性的影响甲酯化修饰对亲和选择性的影响IMAC柱对磷酸肽吸附的选择性样品：磷酸肽+磷酸酶水解去磷酸化肽段混合物使用磷酸钠(钾)溶液洗脱简洁生成碱金属加和峰，使质谱图变得更简单而且使肽段的信号分散，离子信号强度减弱用磷酸氨盐溶液洗脱没有觉察碱金属加和峰洗脱液类型对质谱结果的影响Washbuffer对亲和选择性的影响氨基酸残基的肽段，侧链上的羧基也易与金属离子发生静电作用导致非特异性吸附使用高盐浓度的酸性溶液可削减局部非特异性吸附甲酯化修饰对亲和选择性的影响 对肽段末端及酸性氨基酸残基的羧基进展甲酯化修饰，会提高IMAC亲和柱对磷酸肽的亲和选择性甲酯化反响不能完全进展，一个肽段上修饰不同数目甲基的几种形式会同时存在，分散了肽段的信号强度产生立体异构体，使肽段在反相色谱中的保存也被分裂甲酯化反响过程会造成样本的损失使用要慎重，与常规方法互补IMAC-RPHPLC-MSMS自动化分析平台测试结论，全程自动化，便于转变条件优化试验参数用标准肽的分析说明该体系对磷酸肽具有肯定的选择性亲和富集力量，承受适当的清洗和洗脱溶液会提高亲和提取效率对肽段的酸性氨基酸残基的羧基进展甲酯化修饰，会提高IMAC亲和柱对磷酸肽的亲和选择性，但可能会造成信号分散和样本损失建立了磁性纳米材料制备、选择性富集结合生物质谱分析磷酸肽方法方法特点：修饰过程简洁、快速;无样品损失、高灵敏度；可处理飞摩尔-皮摩尔的样品;高通量。磷酸化蛋白质组分析。RCMJPR上发表。生物素酰肼标记-亲和素纯化富集方法的建立及在肝癌细胞膜糖蛋白争辩中的应用生物素法富集膜糖蛋白流程图三个富集技术路线①：肽段水平富集；②：蛋白水平富集；③：两次富集(蛋白/肽段)(3000cutoff：3000Da超滤)质谱图显示糖肽富集效果富集前富集后富集后三条富集技术路线结果HepG2膜糖蛋白分析会大大减小，因此，承受肽段水平富集方法。结论从蛋白水平富集，对HepG2细胞膜糖蛋白进展争辩，共鉴171个跨膜蛋白，SP44个蛋白是糖蛋白。HepG2细胞膜糖蛋白进展争辩，鉴70个非冗余糖肽，733个肽段248个非冗余糖蛋白。合并蛋白和肽段富集鉴定结果，共83HepG2膜糖蛋白，73个糖基化位点，构建了HepG2肝癌细胞膜糖蛋白数据。这些膜糖蛋白主要是一些免疫相关蛋白、转运蛋白、癌症转移相关的细胞粘附因子以及膜受体等，参与了炎症反响、细胞粘附、信号转导等多种重要生理过程。3、蛋白质定量技术方法蛋白质定量技术方法蛋白质〔组〕定量的意义作为生命执行体的蛋白质，通过其定位、修饰和相互作用发挥功能作用时都与其量的多少相关；蛋白质标志物的觉察与相对定量方法相关；蛋白质标志物的临床应用也涉及到确定定量方法；蛋白质组学〔表达谱、修饰谱和相互作用〕已经向动态蛋白质组学进展，必定要求定量方法的支持。拟解决的关键科学问题规模化蛋白质组确定定量方法的建立；方法的灵敏度、重现性和动态范围优化。不同状态中低丰度蛋白质组的相对定量；相对定量方法动态范围、掩盖率和准确度。非标记定量模式与科学合理的算法。蛋白质定量内容：蛋白质的定量包括确定定量和相对定量，其蛋白质定量的争辩对象包括：(1)纯化后蛋白质确实定定量；(2)总蛋白质确实定定量；简单生物体系中一种或数种蛋白质确实定和相对定量；简单生物体系中大多数及全部蛋白质确实定和相对定量。蛋白质定量的常用方法基于光吸取或放射性质的光谱定量方法，如紫外及可见光吸取和荧光定量方法；基于色谱或毛细管电泳与紫外光吸取定量方法；(3)基于同位素稀释的质谱定量方法；(4)基于凝胶电泳和光密度度的定量方法；(5)基于抗体和荧光标记的定量方法；(6)蛋白质相对定量方法。目前国内外蛋白质定量争辩现状确定定量方法〔1〕光谱定量280nm光吸取蛋白质定量法；LOWRY蛋白质定量法或改进LOWRY蛋白质定量法；BCA蛋白质定量法法；BRADFORD蛋白质定量法；Fluoraldehyde蛋白质定量法；ELISA蛋白质定量法等。(2〕稳定同位素稀释法〔内标法〕用于质谱法进展蛋白质确实定定量；多反响检测蛋白质或肽定量法；规模化蛋白质的半确定定量方法〔基于统计方法。承受蛋白鉴定的分值与相应蛋白质的丰度的关系进展半定量的方法；蛋白质丰度指数〔PAIs，proteinabundanceindices〕与相应蛋白质丰度的关系进展半定量的方法；指数蛋白质丰度指数〔emPAIs，exponentiallymodifiedproteinabundanceindices〕与相应蛋白质丰度的关系进展半定量的方法。相对定量方法在蛋白质水平上，基于两维分别或与荧光标记结合的比较2DE、PF-2DDIGE；基于质谱技术的不同状态的同一种肽段提取的离子流色谱图比较的方法〔非标记定量；稳定同位素标记方法，包括化学标记和代谢标记，如18O水标记、同位素酸酐试剂标记、同位素醛试剂标记、cICAT、iTRAQSILAC等;双功能试剂结合金属标记的方法;(5)同系物标记-SDS-2DE结合质谱的蛋白质相对定量方法。质组的相对定量方法

iTRQA试剂结合生物质谱用于蛋白根本原理试剂的反响基团〔PRG〕特异地与肽段的N-Lys的ε-氨基结合；144Da；(3)在二级质谱图上，报告基团特异性地断裂，其比值即为两样本中蛋白的相对定量。考察因素〔1〕标记完全程度；〔2〕动态范围(30倍，相对误差<30%)；(3)灵敏度;色谱行为，同位素效应不显著；y离子序列。iTRAQMALDITOF-TOFMS的蛋白组相对定量方法。应用：脂肪肝大鼠肝组织全蛋白留意事项：不能引入带有伯氨基的试剂〔复原剂：TCEP；半胱氨酸残基封闭剂：MMTS〔S-甲酯〕；标记过程中水相比例：小于30％；体系不能肽简单，即对于简单生物样本需要预分别步骤。SILAC标记结合生物质谱定量蛋白质组方法的建立和应用细胞培育的稳定同位素标记技术(SILAC)的根本原理：分别用含有自然同位素和稳定同位素5-6代的细胞传代，稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞合成的蛋白质中，从而实现基于质谱的蛋白质组定量分析。方法特点：简洁、直接、高效、准确。应用：查找阳性率高、特异性强的肝癌标志物的争辩课题。TGM2在甲胎蛋白阳性和阴性肝癌细胞中有显著差异，有可能成为肝癌诊断的标志物。DTPA螯合稀土金属标签蛋白质组定量原理和方法流程图试验方法考察结论点：化学试剂价廉易得化学标记反响条件温存，为普遍标记，无肽段卑视肽段的二级图谱为连续的y系列离子，可提高蛋白鉴定的可信度有８种稀土元素是单同位元素，有28种自由组合，可大大扩展质量标签的选择范围基于酸酐双功能试剂修饰关心、结合18O标记的蛋白质组定量方法方法特点18O18O标记方法，无同位素峰重叠MS/MS谱图中是连续的y系列离子，简化图谱，提高鉴定牢靠性标记试剂价廉易得、反响简洁快速、反响体系兼容，为普遍标记的方法18O标记定量方法，节约样本预备的时间、削减试验误差。两种定量结果可以相互验证，显著提高蛋白质组定量的准确性和牢靠性。乙酸酐稳定同位素标记-液质联用蛋白质组相对定量方法开发了自动化定量分析软件：MSAQMALDIMS试验流程ESIMS试验流程方法特点：标记试剂价格低廉、反响条件温存。应用1：国际脑脊液工程合作争辩工程，即亨廷顿病人脑脊液中蛋白质的变化；应用：对正常比照