2 编制说明《植物源性食品中叶绿素的测定 高效液相色谱法》

《植物源性食品中叶绿素的测定高效液相色谱法》农业行业标准编制说明起草单位：农业农村部食物与营养发展研究所。负责人：朱大洲联系电话箱：zhudazhou@一、工作简况，包括任务来源、协作单位、主要工作过程、标准主要起草人及其所做的工作等；（一）任务来源根据农质标函〔2020〕128号农业农村部农产品质量安全监管司关于下达2020年农业国家标准和行业标准制修订项目计划的通知（2020年7月31日印发）,由农业农村部食物与营养发展研究所主持承担《植物源性食品中叶绿素的测定高效液相色谱法》的制定（项目编号：HYB-20144），承担方法建立、方法验证及相关起草工作。（二）主要起草单位农业农村部食物与营养发展研究所等。（三）编写人员与分工表1.主要起草人员信息及任务分工姓名单位职称专业特长及分工（四）主要工作过程（应包含起草、征求意见、送审等环节的时间及具体情况。）2020年7月至2020年9月，成立了标准起草小组，负责标准起草、验证、征求意见等工作；在前期示范推广应用的基础上，启动制标程序，着手调研与资料收集，标准编制小组查阅收集了国内外相关方法、论文等资料文献，比较研究了国内外的不同测定方法的优缺点，为本标准制定提供了基础资料支撑。2020年10月至2020年11月，收集有代表性的样品，分析检测，以验证标准的适用性。2020年12月至2021年6月，完成叶绿素检测试验条件优化、方法建立、方法验证等工作。2021年7月至2022年3月，完成《植物源性食品中叶绿素高效液相色谱法》标准草案、编制说明的编写及相关材料的准备。二、标准编制原则和确定标准主要内容（如技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规则等）的论据（包括试验、统计数据），修订标准时，应增列新旧标准水平的对比；（一）标准编制依据和原则本标准的编写制定过程以提高方法选择性、精密度、灵敏度、准确度和分析效率，降低分析成本为总原则。力求反映科学技术的先进成果和先进经验，使用性能的普遍性，包括方法精密度、准确度、灵敏度等方面能满足要求，确保标准，保持技术上的先进性，又具有经济上的合理性。遵循了标准制定过程中的先进性、经济性和适用性原则。在标准的制定过程中严格遵循国家有关方针、政策、法规和规章，严格执行强制性国家标准和行业标准。在GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》和GB/T20001.4-2015《标准编写规则第4部分：试验方法标准》的指导下，与同体系标准及相关的各种基础标准以及配套使用的取样、试剂规格等标准相衔接，遵循了政策协调统一性原则。在标准制定过程中力求做到：技术内容的叙述正确无误；文字表达准确、简明、易懂，标准的构成严谨合理，内容编排、层次划分等符合逻辑与规定。（二）标准主要内容通过查阅文献、专利和相关标准，明确了植物源性食品中叶绿素定量测定主要技术方法，通过系统研究确定叶绿素的高效液相色谱测定方法，主要内容包括标准适用范围、规范性引用文件、原理、试剂、仪器设备、分析步骤、分析结果的表述等。首先确定叶绿素的液相色谱参数，优化液相条件，提取条件，研究了方法检出限和定量限，加标回收率和测定精密度，通过三方验证检验方法的可靠性。三、主要试验（或验证）的分析、综合报告，技术经济论证，预期的经济效果；（一）仪器条件的选择仪器条件的选择包括流动相和检测波长。波长扫描：3D全波长扫描模式。流动相：甲醇-水梯度洗脱。图1叶绿素a3D全波长扫描谱图图2叶绿素b3D全波长扫描谱图由图1和图2可知，叶绿素a最佳吸收波长是665nm，叶绿素b最佳吸收波长是468nm。对比甲醇-水梯度洗脱程序，结果显示甲醇等度洗脱得到叶绿素a和叶绿素b分离度大于2，峰形对称性良好。确定最佳仪器条件为：色谱柱：C18色谱柱，5μm，150mm×4.6mm（内径）或相当者；柱温：30℃；流动相：甲醇；流速：1.0mL/min；检测波长：468nm，665nm；进样量：10μL。（二）方法条件的优化1、试样的制备试样取可食部分经匀浆机匀浆或高速粉碎机或组织捣碎机粉碎均匀后，储存于样品瓶中，样品现用现制备。称取干样品0.1g-0.5g，湿样品0.5g-2.0g（样品精确至0.0001g）。2、试样前处理条件的选择和优化在参考国内外方法和文献研究的基础上，以提取溶剂的类型（A）、提取方式（B）、提取时间（C，min）为考察因素，叶绿素提取率的高低为评价指标，采用L16(43)正交试验设计对绿宝石甜瓜、黑米和菠菜中叶绿素的提取方法进行优化。因素和水平见表2。表2.因素与水平水平因素ABC,min1无水乙醇超声提取2min2甲醇涡旋振荡提取5min3乙醇:丙酮=1:150℃水浴振荡提取10min4甲醇:二氯甲烷=3:175℃水浴振荡提取15min表3.绿宝石甜瓜正交试验设计与结果序号因素叶绿素含量A溶剂B方式Cmin（mg/kg）111117.20212227.96313320.60414423.90521232.32622133.26723429.64824331.58931328.161032420.971133128.381234226.651341429.281442332.851543230.191644132.35`k122.4226.7427.80`k231.7028.7629.28`k326.0427.2028.30`k431.1728.6225.95R8.732.023.33表4.绿宝石甜瓜方差分析结果变异来源平方和自由度均方F比显著性A提取溶剂234.52378.178.14**B提取方式12.2834.09C提取时间23.4637.82D(误差)79.54613.26注：F0.05(3,12)=3.49，F0.01(3,12)=5.95绿宝石甜瓜正交试验结果分析如表3所示，方差分析结果如表4所示。由表3可知，各因素对叶绿素提取率影响程度的结果排序为A>C>B，即提取溶剂>提取时间>提取方式，由表4方差分析结果可知，提取溶剂对叶绿素提取率存在显著性影响（P<0.05），提取方式和提取时间对叶绿素提取率无显著性影响（P>0.05）。综合考虑极差分析和方差分析结果，确定最优条件为A2B1C1，即为甲醇溶液，超声提取提取2min。表5.黑米正交试验设计与结果序号因素叶绿素含量A溶剂B方式Cmin（mg/kg）111110.7721228.80313315.96414410.38521220.29622117.87723420.33824320.76931316.571032414.921133116.811234219.911341418.571442319.451543218.761644116.97`k111.4816.5515.60`k219.8115.2616.94`k317.0517.9618.19`k418.4417.0016.05R8.332.702.58表6.黑米方差分析结果变异来源平方和自由度均方F比显著性A提取溶剂160.45353.48212.73**B提取方式15.1235.042C提取时间15.5335.177D(误差)19.7763.29注：F0.05(3,12)=3.49，F0.01(3,12)=5.95黑米正交试验结果分析如表5所示，方差分析结果如表6所示。由表5可知，各因素对叶绿素提取率影响程度的结果排序为A>B>C，即提取溶剂>提取方式>提取时间，由表6方差分析结果可知，提取溶剂对叶绿素提取率存在显著性影响（P<0.05），提取方式和提取时间对叶绿素提取率无显著性影响（P>0.05）。综合考虑极差分析和方差分析结果，确定最优条件为A2B1C1，即为甲醇溶液，超声提取提取2min。表7.菠菜正交试验设计与结果序号因素叶绿素含量A溶剂B方式Cmin（mg/kg）11111280.5821221022.2231331076.7341441117.1052121120.1962211120.1272341170.6582431086.9993131176.56103241211.01113311066.96123421088.51134141108.86144231125.86154321081.6516441857.72`k11124.161171.551081.34`k21124.491119.801078.15`k31135.761099.001116.54`k41043.521037.581151.90R92.24133.9773.76表8.菠菜方差分析结果变异来源平方和自由度均方F比显著性A提取溶剂21827.0337275.68B提取方式36852.59312284.201.69C提取时间14392.7534797.58D(误差)50803.6068467.27注：F0.05(3,12)=3.49，F0.01(3,12)=5.95菠菜正交试验结果分析如表7所示，方差分析结果如表8所示。由表7可知，各因素对叶绿素提取率影响程度的结果排序为B>A>C，即提取方式>提取溶剂>提取时间，由表8方差分析结果可知，提取溶剂、提取方式和提取时间对叶绿素提取率均不存在显著性影响。综合考虑极差分析和方差分析结果，及绿宝石甜瓜和黑米的正交实验结果，确定最优条件为A2B1C1，即为甲醇溶液，超声提取提取2min。（三）方法学的验证1、方法的线性范围(1)标准储备液（100μg/mL）：分别称取叶绿素a、叶绿素b标准品1.00mg（精确至0.01mg）于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶液溶解并定容至刻度。标准储备液充氮避光置于-18℃或以下的冰箱中有效期3个月。(2)标准工作液:分别移取标准储备液（5.4.1）0.05mL、0.10mL、0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL到10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶液（5.1.4）定容至刻度，得到浓度为0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL、5.00μg/mL、10.00μg/mL、20.00μg/mL的系列标准工作液，现用现配。将标准系列工作液分别注入液相色谱中，测定相应的峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表9。表9.叶绿素a、叶绿素b标准曲线方程和浓度范围组分回归方程相关系数浓度范围（µg/mL）叶绿素ay=35.622x0.99980.50-20.00叶绿素by=55.253x0.99910.50-20.00由表9可见，叶绿素a、叶绿素b线性关系良好，可以满足检测要求。2、方法的检出限和定量限取样品按照实验建立方法处理，上机测定观察信噪比，适当进行稀释，检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别以3和10倍的信噪比计算。当样品取样量为2.0g，定容体积为5mL时，叶绿素a的检出限为0.06mg/kg，叶绿素b的检出限为0.03mg/kg。当样品取样量为2.0g，定容体积为5mL时，叶绿素a的定量限为0.2mg/kg，叶绿素b的定量限为0.1mg/kg。3、方法的精密度选取含有叶绿素a、叶绿素b的水果、谷物、蔬菜、茶饮等代表性食品，以绿宝石甜瓜、黑米、菠菜、绿茶为研究对象，平行测定6次，考察检测方法的精密度。表10.精密度测定结果（n=6）样品名称组分测定结果（mg/kg）RSD（%）123456平均值绿宝石甜瓜叶绿素a20.9519.0420.8920.4219.6720.6520.953.75叶绿素b7.466.997.667.446.997.077.463.94黑米叶绿素a10.3410.5910.9910.0911.0910.1910.553.96叶绿素b7.487.407.757.387.657.167.472.82菠菜叶绿素a861.04805.57828.91814.88788.37836.54822.553.09叶绿素b358.50321.63331.35325.61332.90342.11335.353.97绿茶叶绿素a30.2529.3330.2129.5232.4532.6530.734.73叶绿素b46.7945.2045.2843.1546.2841.5844.714.43ND表示未检出根据GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求，被测组分含量为100mg/kg，实验室内变异系数为5.3%，被测组分含量为10mg/kg，实验室内变异系数为7.5%，被测组分含量为1mg/kg，实验室内变异系数为11%，由表10可知，样品中叶绿素a、叶绿素b6次平行实验测定结果的相对标准偏差均小于5.3%，表明该方法的精密度良好，适合定量分析。4、方法的回收率回收率公式如下：QUOTEX1-X0m式中，P-加入的标准物质的回收率；m-加入的标准物质的量；X1-加标试样的测定值；X0-本底的测定值。分别准确称取绿宝石甜瓜、黑米、菠菜、绿茶样品，向样品本底添加低、中、高三个浓度水平的标准溶液，进行三水平六平行加标回收实验，计算叶绿素a、叶绿素b的回收率和相对标准偏差。表11.回收率验证结果（n=6）样品名称组分本底值mg/kg加标量mg/kg加标回收率%RSD%123456平均值绿宝石甜瓜叶绿素a20.279.5291.2195.7197.1296.7595.3494.0495.032.2819.0495.7598.6393.395.3894.7194.2395.331.9228.5695.4399.9596.8895.8594.298.6496.832.21叶绿素b7.273.8798.5292.4799.697.8597.8899.4797.632.707.7496.3297.07100.6396.3299.7596.7797.811.9311.6196.8797.4795.7496.8798.1897.1297.040.83黑米叶绿素a10.554.9694.0390.4595.893.2395.6493.793.812.089.9297.3196.6399.5495.7295.1894.3696.461.9014.88101.99101.13102.0999.84103.4999.57101.351.47叶绿素b7.473.89100.2596.2397.4594.7198.796.797.342.007.7894.29100.799.4499.2396.71101.2598.602.6711.67106.73102.89100.53105.86104.2899.97103.382.67菠菜叶绿素a833.52397.2290.3691.5397.3690.2891.5292.2392.212.85794.4496.9695.0990.8390.9898.8999.2395.333.921191.6698.5792.91106.4895.56102.23102.2399.664.98叶绿素b338.58193.80101.4796.8890.7393.3192.2893.5694.714.10387.6096.3291.2691.6294.5696.6594.4394.142.42581.4093.4890.4192.9892.3896.6995.5693.582.41绿茶叶绿素a31.1215.76101.3892.3299.5899.9695.6593.6897.093.8331.5398.7997.0899.2594.7692.7695.7496.402.5747.2992.7694.2893.9195.6393.3492.2893.701.27叶绿素b35.5219.6294.7291.9590.6492.9395.4893.6793.231.9139.24101.0396.0699.5796.9596.7995.2597.612.2758.8692.3494.0699.2693.9794.3691.1394.192.95根据GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求，被测组分含量在1-100mg/kg时，回收率范围在90%-110%之间，被测组分含量在0.1-1mg/kg时，回收率范围在80%-110%之间，被测组分含量在<0.1mg/kg时，回收率范围在60%-120%之间。由表11知，绿宝石甜瓜、黑米、菠菜、绿茶样品中叶绿素a、叶绿素b的平均加标回收率分别在94.23%-106.37%、90.10%-103.45%、90.22%-103.58%之间，加标回收率的相对标准偏差均小于5.3%，各组分回收率结果满足GB/T27404-2008的要求，表明方法回收率高，适合植物源农产品中叶绿素a、叶绿素b含量的测定。5、方法的特异性选取绿宝石甜瓜、黑米、菠菜、绿茶和苹果样品，按照实验建立的方法进行前处理和测定，采集谱图与标准溶液谱图对照，以验证方法的特异性。结果表明，叶黄素a和叶黄素b的保留时间分别为11.802min和6.577min；苹果样品在标准出峰时间处无信号峰；绿宝石甜瓜中叶黄素a和叶黄素b的保留时间分别为11.787min和6.559min；黑米中叶黄素a和叶黄素b的保留时间分别为11.785min和6.564min；菠菜中叶黄素a和叶黄素b的保留时间分别为11.782min和6.560min；绿茶中叶黄素a和叶黄素b的保留时间分别为11.796min和6.567min。表明本方法不受样品本底的干扰，特异性良好，结果见图3。（A）（B）（C）（D）（E）（F）图3.混合标准溶液和样品中叶绿素高效液相色谱图（A）标准品；（B）绿宝石甜瓜；（C）黑米；（D）菠菜；（E）绿茶；（F）苹果6、样品测定选择水果、谷物、蔬菜、茶饮等30余个样品，按实验建立的方法，在重复性条件下独立测定3次，计算不同样品中叶绿素a和叶绿素b的含量和相对标准偏差。结果显示，各样品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值均小于算术平均值的10%。结果见表12。表12.不同样品测定结果（n=3）样品名称组分平均值（mg/kg）RSD（%）红富士苹果叶绿素aNDND叶绿素bNDND脐橙叶绿素aNDND叶绿素bNDND绿宝石甜瓜叶绿素a24.180.64叶绿素b8.032.45香蕉叶绿素aNDND叶绿素bNDND黄心猕猴桃叶绿素aNDND叶绿素bNDND白肉火龙果叶绿素aNDND叶绿素bNDND水晶梨叶绿素aNDND叶绿素bNDND西蓝花叶绿素a67.11.25叶绿素b25.63.55芹菜叶绿素a107.902.45叶绿素b49.561.78豌豆荚叶绿素a67.573.12叶绿素b16.776.45紫洋葱叶绿素aNDND叶绿素bNDND西红柿叶绿素aNDND叶绿素bNDND菠菜叶绿素a844.301.25叶绿素b275.900.83玉米叶绿素aNDND叶绿素bNDND苦荞叶绿素aNDND叶绿素bNDND糙米叶绿素aNDND叶绿素bNDND藜麦叶绿素a2.030.20叶绿素b1.652.12黑米叶绿素a10.490.34叶绿素b7.381.68黄豆叶绿素aNDND叶绿素b0.0856.16枸杞叶绿素aNDND叶绿素bNDND核桃叶绿素aNDND叶绿素bNDND花生叶绿素aNDND叶绿素bNDND红豆粉叶绿素aNDND叶绿素b0.0683.57纳豆冻干粉叶绿素aNDND叶绿素bNDND多种莓果麦片叶绿素aNDND叶绿素bNDND贡菊叶绿素a20.466.27叶绿素b13.742.82金丝皇菊叶绿素a2.771.38叶绿素b3.415.29红茶叶绿素a5.851.38叶绿素b4.952.54绿茶叶绿素a12.530.81叶绿素b47.823.12白茶叶绿素a85.666.79叶绿素b53.156.27黑茶叶绿素aNDND叶绿素bNDND茉莉花茶叶绿素aNDND叶绿素b4.021.13碧螺春叶绿素a4.721.12叶绿素b40.192.58雪毫花茶叶绿素aNDND叶绿素b4.931.21ND表示未检出（三）实验室间验证经三家实验室验证，本方法的线性范围、精密度、回收率、检出限和定量限等满足植物源农产品中叶绿素a、叶绿素b的测定要求。四、采用国际标准和国外先进标准的程度，以及与国际、国外同类标准水平的对比情况，或与测试的国外样品、样机的有关数据对比情况；叶绿素，是植物进行光合作用的主要色素，是一类含脂的色素家族，位于类囊体膜。叶绿素吸收大部分的红光和紫光但反射绿光，所以叶绿素呈现绿色，它在光合作用的光吸收中起核心作用。叶绿素为镁卟啉化合物，包括叶绿素a、b、c、d、f以及原叶绿素和细菌叶绿素等。叶绿素可反映植物的生长发育状况、生理代谢变