人类外显子组测序结题报告

2.1实验流 SNP和InDel检测 SNP和InDel的注释 SNP对蛋白结构及功能影响注释 群体SNP和InDel检 .......................................................................................................................................................2014 2.1实验流每个样本的组DNA随机打断成150~200bp的片段并构建文库，参照SureSelectXT SystemforIlluminaPaired-EndSequencingLibraryIlluminaHiSeqandMiSeqMultiplexedSequencingPlatforms2-1Agilent外显子捕获流完成后，将片段与参考组进行比对，进行数据统计分析及后续生物信息学分析。生物信息分析流程如图2-2：2-2生物信息分析流见下表（√打勾部分√√√√√√候选GO和KEGG代谢通路分√√IlluminaHiseq2000得到的原始图像数据经过BaseCalling转化为序列数据，以FASTQ文件格式来，是用户得到的最原始的数据文件。FASTQ格式文件包含reads的序列信息以及reads的质量信息。数据@HWI-ST531R:144:D11RDACXX:4:1101:1212:19461:N:0:ATTCCT+HWI-ST531R:144:D11RDACXX:4:1101:1212:1946每条read4行信息，其中第一行和第三行分别由文件识别标志和读段名（ID）组成（第一行以“@”开头而第三行以“+”开头；第三行中ID可以省略，但“+”不能省略），第二行为碱基序列，而第四行是第二行为方便保存和共享各产生的高通量数据，NCBI数据中心建立了大容量的数据库equenceReadArchive, Illumina属于第二代技术，单次运行能产生数十亿级的reads，如此的海量数据无法逐个展示每条read的质量情况；生物信息运用统计学的方法，对所有reads的每个circle进行碱基分布和质量波动统计，得到原始数据后，对结果进行统计和评估，根据接头信息去除那些有接头污染的序列。如下为原始数据的结果统计表以及质控图：图3-1为原始数据碱基分布图(又称为GC偏差图)3-2为原始数据碱基质量分结 样本名 样本名 该部分的统计结果见表该部分的统计结果见表3-1，质控图见图3-1及图3-

表3- Raw Raw Clean lean3-1A1原始数据的碱基注：横坐标是reads碱基坐标，纵坐标是所有reads的A、C、G、T、N碱基分别占的百分比。组项目中如 直线。从图1可知，该文库碱基分布均匀，N%3-2A1原始数据的碱基质量分布readsreads的碱基质量（SolexaScale40=Highest15=Lowest），图中垂直红线“Ⅰ”指定的范围是所有reads碱基的综合质量，红色垂直方块是质量的四分位值范围，加黑粗线是质量值的中位数。从图2可知，获得的数据达到后续分析要求。该部分的统计结果见表3-2和表3-使用BWA将片段比对回参考组，并使用Picard去除PCR-duplication产生的序列本该部分的统计结果见表3-2和表3-Data)SNP和InDel行质量值的重新校正，最后再结合dbsnp信息进行SNP和InDel的检测。使用的dbsnp信息如下： ationUrl=ftp://ftp.ncbinlmnih.在SNP和InDel的检测过程中，要求突变位点的深度大于等于5，即支持该变异的片段数目要大于等于5。 为individuals_snp_indel/， 样本名/*.snp.vcf：样本的SNP结果文件，以vcf格式。样本名/*indel.vcf：样本的InDel结果文件，以vcf格式。 ） netmpleup.shml该部分的统计结果见表该部分的统计结果见表3-3-4SNPInDel结果统计SNPInDelSNP和InDelexonic区域的SNP和InDel突变位点，将会对突变位点对蛋白翻译的影响进行注释。 为individuals_snp_indel/， 样本名/*.snp.anno.txt：样本的SNP样本名/*indel.anno.txt：样本的InDel该部分的统计结果见表该部分的统计结果见表3-5至3-表3-5SNP注释结果统计15131422255434366555表3-6InDel注释结果统计999900010001000231211134222324342248894656691010111111**表3-5和表3-6具体描述和说明参考 表3-7SNP对蛋白翻译影响结果统计999969表3-8InDel对蛋白翻译影响结果统计232312321114125304420121011111**表3-7和表3-8中unknown是由于注释文件中的ORF不完整导致无法进行判3.6SNP对蛋白结构及功能影响注会导致编码的氨基酸产生改变。对多序列比对结果和3D结构数据的分析，可以得到氨基酸突变对蛋白质结构和SIFT（SotingntoleantFromoleanthelp.html#SIFT是一个可以氨基酸突变对蛋白质影响的。通过目标序列与其近似序列的比对（PSI-BLAST可以知道目标序列中氨基酸残基的保守程度，SIFT就是通过氨基酸的保守程度进行的。 位点的特异性判断对分子结构和功能的影响；2、PSIC值，用来衡量突变在蛋白质的罕见程度；3、分子级结构及相关信息，包括二级结构、可溶性表面积及Phi-psi二面角；43D结构，将突变氨基酸替换到蛋白质分子的3D结构中看该突变是否会破坏蛋白质的疏水。结 样本名/*.snp.sift.txt：样本SNP的SIFT结样本名/*.snp.polyphen.txt：样本SNP的Polyphen2结 的结果统计见表3-9和表3-表3-9SIFT结果的统计表3-10PolyPhen2结果的统计群体SNP和InDel根据每个最终的比对结果，利用GATK获得10个样本的群体SNP信息和群体InDel信息。结果以vcf文件格式保存。群体SNPInDel的检测过程中，SNP的质控过滤标准为："QUAL30.0||QD5.0||HRun5||SB0.10"。InDel的质控过滤标准为："MQ04&&((MQ0/(1.0*DP0.1SB1.0QUAL10"。具体的过滤方式可参考vcf文件开头以"##FILTER"为起始部分的说明。参数的含义可参考vcf文件开头以"##INFO"为起始部分的说明根据Agilent捕获在人类组上捕获区域的位置信息，过滤掉不在捕获区域内的SNP，InDel检测结果。再根据人类dbsnp信息，过滤掉人群SNP位点（通常与疾病无关。 为multi_result/， multi_snp.vcf：通过质控得到的原始SNP结果multi_indel.vcf：通过质控得到的原始InDel结果multi_snp.bedFilter.vcf：经过捕获区域过滤之后的SNP结果multi_indel.bedFilter.vcf：经过捕获区域过滤之后的InDel结果multi_snp.bedFilter.dbsnpFilter.vcf：经过dbSNP过滤之后的SNP 3-11SNP信息InDel信息结果统AfterCaptureRegionAfterdbsnpSNP和InDel根据过滤之后的2,782个群体SNP位点和540个群体InDel位点，采用PLINK计算在疾病样本和正常样本中次等位的频率，利用FisherExactTest判断突变位点与疾病否存在非随机相关性。检验的P值越低则2,782SNP540InDel位点进行注释。给出突变的变异类型，突变对蛋白翻译的影响，以及对应的hyperlink（包含对应的序列，通路，疾病数据库等信息。结 multi_snp.assoc.fisherhsa.anno.txt：群体SNP的Fisher精确检验和注释结果multi_indel.assocfisherhsa.anno.txtInDelFisher精确检验和注释结果 检验P值 ID名|Hyperlink数据 ID名|Hyperlink数据**POS坐标形式与vcf这部分的结果统计见表这部分的结果统计见表3-P-InDel219 ||--* ||--*f SNP和InDel的结果文件||-- ||-- 样本InDel结果文||-- ||-- ||-- 样本SNP的SIFT结||-- 样本SNP的Polyphen2结 SNP和群体InDel||-- 通过质控得到的原始SNP结||-- ||-- 的||-- 的||-- dbSNP过滤之后SNP结||-- dbSNP过滤之后InDel结||--multi_snp.assoc.fisher ||--multi_indel.assocfisher 所有提供的文件均为Linux系统下的文件，压缩包使用“tarzcvf命令压缩，以下为不同系统用户解压缩的Unix/Linux/Mac用户:tarzcvf*.tar.gzWindows用户：使用WinRAR解压如果在本附录中无特殊说明，所有提供的文件均为Linux系统下文本文件，Unix/Linux用户可以使用more或less命令查看文本文件内容。对于Windows用户，一般文本文件可以使用写字板或excel打开。使用开源文本编辑器geditforwin32版本( )或者商业文本编辑器UltraEdit。当文件比较大时，打开文件可能导致Windows系统死机，建议使用性能较好的计算机或者使用更适合处理大量数据的Unix/Linux以使用浏览器打开，Linux/Unix用户使用displa