实验三、细胞中酸性磷酸酶的定位课件

实验三、细胞中酸性磷酸酶的定位

一、实验目的1.了解并掌握酸性磷酸酶定位的原理及操作步骤。2.观察酸性磷酸酶在细胞中的分布。二、实验原理

酸性磷酸酶（ACP）是溶酶体的特征性酶，主要存在于巨噬细胞,定位于溶酶体内。正常条件下,巨噬细胞处于休止状态,酶活性很低。但在合适的pH条件下，经过活化，其形态、代谢和功能上表现出一系列显著的变化，如膜活性增高和酸性磷酸酶活性增强，从而改变其渗透性底物可以渗入,酶活力被显示。三、实验材料、试剂和仪器1.材料

小白鼠2.试剂1)甲醛钙固定液：甲醛10ml,10%氯化钙10ml,蒸馏水80毫升。2)酸性磷酸酶作用液:称取硝酸铅25mg,加0.05mol/L乙酸缓冲液22.5ml,搅动使之全部溶解后,再缓慢地滴加3%β-甘油磷酸钠液2.5ml,边加边搅动防止产生沉淀,总量25ml.(现配制,不能储存)。3)2％硫化铵溶液：硫酸铵2毫升＋98毫升水。4)0.05mol／L乙酸缓冲液。A液（0.2mol/L乙酸液）：冰醋酸1.2ml加蒸馏水100ml。

B液（0.2mol/L乙酸钠液）：NaAc.3H2O2.72g加蒸馏水至１00毫升。取A液３０毫升＋B液70毫升＋蒸馏水300毫升。6)6%淀粉肉汤:牛肉膏0.3g,蛋白胨1.0g,NaCl0.5g,可溶性淀粉６.0g，蒸馏水１00ml，煮沸灭菌，４℃保存，使用时热水浴融化。

3.仪器、用具：注射器、恒温水箱、显微镜、擦镜纸、

解剖盘、解剖剪、盖玻片、吸水纸。四、实验方法与步骤１.前处理

（１）小白鼠每日腹腔注射６％淀粉肉汤１ml，连续注射３天．

（２）在第３－４天,再向腹腔注射１ml生理盐水，过３～５min用颈椎脱臼法处死小鼠，剖开腹腔，把内脏推向一侧，用不带针头的注射器或吸管吸取腹腔液．２.制片1.将腹腔液滴一滴于冰冻的干净载玻片上，涂开，自然干燥。2.放入作用液中，37℃保温30min。3.蒸馏水漂洗片刻。4.放入甲醛钙固定液中固定5min。5.蒸馏水漂洗片刻。6.放入2%硫化铵液3-5min。7.蒸馏水漂洗,镜检。3.对照实验:

标本放入作用液前先用高温（50℃）处理30min,使酶失去活性，做好标记，其它步骤同上3-7步。2.腹腔注射1.小鼠腹腔注射可以用5ml的注射器，配合5.5～7号针头。

2.腹腔注射时右手持注射器，左手的小指和无名指抓住小鼠的尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下。这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。进针的动作要轻柔，防止刺伤腹部器官。

3.尤其是对于体重较小的小鼠，腹腔注射时针头可以在腹部皮下穿行一小段距离，最好是从腹部一侧进针，穿过腹中线后在腹部的另一侧进入腹腔。

3.小鼠的处死脊柱脱臼法用左手拇指和食指捏住小白鼠头的后部，并用力下压，右手抓住鼠尾，用力向后上方拉，即可使颈椎脱臼，瞬间死亡。皮肤和腹膜要分别剪开，并确保皮肤血液不流入腹腔。腹腔内的冲洗液要全部吸干。七、相关理论知识巨噬细胞（MΦ）发育：骨髓多能干细胞→定向干细胞（髓样干细胞）→单核母细胞→前体单核细胞→单核细胞→血液→组织（分化为巨噬细胞）MΦ分布：单核细胞主要于血液中，巨噬细胞几乎存在于所有表皮和黏膜下组织。MΦ形态：有伪足，马蹄状单核，细胞形体大。MΦ分离纯化：小鼠和大鼠腹腔内有丰富的巨噬细胞，可用腹腔清洗的方法获得较多细胞悬液。正常小鼠每只可收集腹腔渗出细胞106，其中30%为巨噬细胞，如果给小鼠腹腔注射某种刺激物，可使巨噬细胞渗出增加，易于分离更多的巨噬细胞。

2.巨噬细胞的特性

组织中的巨噬细胞则呈显著的多形性，在培养条件下对塑料或玻璃表面具有极强的粘附性，一次可利用这一特性分离巨噬细胞并与非粘附性细胞分开，但其作用机制不详。巨噬细胞在体内可借其表面粘附分子与其它细胞或细胞外基质黏附在一起。

巨噬细胞的另一特性是对异物通过不同机制具有吞噬作用（phagocytosis）,吞饮（endocytosis）或胞饮作用（pinocytosis）。可将异物吞入胞内，并借其胞浆内的大量液泡及颗粒中的内含物和代谢产