03物理图谱与测序2公开课一等奖省优质课大赛获奖课件

第三章

DNA物理图谱构建及序列测定物理图谱（physicalmap）物理图/限制性图谱（restrictionmap）是各种限制性内切酶切点在某一DNA分子或DNA片段上排列，因为各酶切点之间距离是以碱基对（kbp→mbp）表示，所以可计算出二切点间绝对距离，所以限制图也称物理图。物理图谱构建是基因组研究主要组成部分。质粒pBR322限制图一、限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）

细菌核酸内切酶识别、剪切特殊双链DNA序列用途：DNA物理图谱构建、DNA序列分析、基因分离、基因定位、DNA重组1.细菌修饰作用和限制性核酸内切酶发觉20世纪50年代，Luria&Human、Bertani&Weigle：噬菌体→细菌菌株1，正常生长。→细菌菌株2，生长受到强烈抑制；少数存活，再次感染菌株2，正常生长——受到宿主特意修饰。机制？E.coli菌株λ噬菌体感染率KBCE.coliK110-410-4E.coliB10-4110-4E.coliC111111962，Arber：宿主修饰在噬菌体DNA上进行1965，Arber：宿主对入侵噬菌体修饰与噬菌体DNA降解亲密相关；预言细菌中存在位点特异性限制酶；修饰是宿主甲基化酶作用结果：建立细菌限制-修饰（R-M）系统概念。Arber假说细菌中存在含有相同位点特异性2种酶：限制性内切核酸酶；甲基化酶细菌限制-修饰系统是抵抗外来侵袭一个主要办法1978年诺贝尔生理学或医学奖

限制性核酸内切酶发觉1968年，Linn&Arber于大肠杆菌B中发觉第一个限制性内切核酸酶（I型：识别特异剪切随机）。1968年，Meselson&Yuan从大肠杆菌K中取得高纯度限制性内切核酸酶（I型）。1970年，Smith从流感嗜血杆菌Rd中分离出第一个II型限制性内切核酸酶——HindII。流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）能快速降解外源噬菌体DNA，其细胞提取液可降解E.coliDNA，但不能降解本身DNA，→HindⅡ限制性内切酶。HindⅡ限制性内切酶位点和切割位点以下：

5'…GTPy↓PuAC…3'

3'…CAPu↑PyTG…5'

上世纪80年代，限制性内切酶开始克隆表示限制-修饰系统Smith等工作流感嗜血杆菌Rd与其它细菌相同DNA碱基化程度低：m5C，N6-mA；但存在甲基化酶细胞粗提物→磷酸纤维素层析→蛋白；*

S-腺苷甲硫氨酸转移甲基→鱼精DNA/T7DNA。——检测出4种腺嘌呤甲基化酶其中一个处理T7DNA→免受HindII裂解；先用HindII处理鱼精DNA→对应甲基化位点破坏。——限制性内切酶-修饰性甲基化酶共识别位点限制性内切酶识别位点处甲基基团伸入到双螺旋大沟中去，妨碍了限制性内切酶作用。磷酸纤维素层析——阳离子交换层析氨基酸等点点（isoelectricpoint，pI）

在一定pH条件下，氨基酸分子中所带正电荷和负电荷数相等，即净电荷为零，此时溶液pH称为该氨基酸等电点(isoelectricpoint,pI)

。氨基酸在等电点时溶解度最小。正离子pH<pI两性离子pH=pI负离子pH>pI离子交换层析分离蛋白质甲基转移酶催化甲基化（methylation）甲基供体：S-腺苷甲硫氨酸甲基受体：被修饰碱基（A、C多于G、T）碱基甲基化修饰不是随机，而是限于一定次序或DNA某一区域，在甲基化酶作用下进行，甲基化是可逆。甲基化意义：帮助细胞识别和区分本身DNA和外来DNA；调整基因表示；帮助DNA修复等。腺苷转移酶PPi+Pi+甲硫氨酸ATPS-腺苷甲硫氨酸(S-腺苷Met，SAM)S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶RHR—CH3腺苷SAMS—腺苷同型半胱氨酸同型半胱氨酸SAM为体内甲基直接供体

H2O腺苷或胞嘧啶甲基化是各种细菌限制修饰系统一部份

真核生物中也存在广泛DNA甲基化修饰现象

哺乳动物DNA甲基化修饰和X染色体失活、胚胎发育、组织分化乃至癌症亲密相关。真核生物，修饰则影响基因表示。大多数情况下，甲基化修饰造成基因表示缄默。而且这种修饰在细胞有丝分裂时能够代代传递新遗传学分枝--表观遗传学2.限制性内切酶种类与特征限制性内切酶形式多样大小：PvuII（157个氨基酸）；CjeI（1250个氨基酸）。纯化分类3000余种限制性内切酶，超出250种特异识别序列。研发工作仍在继续：分析细胞提取物，计算机分析已知基因组数据。同裂酶（识别序列与已经有重复）；新识别位点传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等原因划分为三大类。然而，蛋白测序结果表明，限制性内切酶改变各种多样，若从分子水平上分类，则应该远远不止这三种。

I型限制性内切酶

兼有限制性内切酶和修饰酶活性多亚基蛋白复合体(3x105-4x105Da)，需Mg2+、ATP、SAM。在识别位点很远地方任意切割DNA链：EcoB识别位点——TGA*（N）8TGCT；EcoK识别位点——AA°C（N）6GTGC（A为可能甲基化位点，N表示任意碱基）。切割位点在识别位点1000bp以外，且无特异性。不产生确定限制片段，不具备实用性。II型限制性内切酶种类多（2x104-10x104），需Mg2+激活绝大多数Ⅱ酶识别序列/切割位点由4～8个核苷酸多以同二聚体结合于DNA，识别对称序列；极少作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续序列（EcoRI：GAATTC）；另一些识别不连续序列（BglI：GCCNNNNNGGC）。切割后产生一个3‘羟基端和一个5’磷酸基团对应修饰酶需要S-甲硫氨酸腺苷存在IIS型限制性内切酶Ⅱ型含有相同辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断，长度为4-7bp，切割位点可能在识别位点一侧20bp范围内（如FokI和AlwI）。III型限制性内切酶兼有限制-修饰两种功效，需Mg2+、ATP；当ATP、SAM同在时，DNA分解与甲基化同时进行识别位点之外切开DNA链：EcoP1和EcoP15识别位点分别是AGACC和CAGCAG，切割位点则在下游24-26bp处。极少能产生完全切割片段，不具备实用价值。3.识别位点序列测定1970年，Smith建立：碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase）T4多聚核苷酸激酶（T4PolynucleotideKinase）胰腺脱氧核糖核酸酶（DNaseI）蛇毒磷酸二酯酶（snakevenomphosphodiesterase）电泳碱性磷酸酶T4多聚核苷酸激酶T4多核苷酸激酶是一个磷酸化酶，可将ATPg-磷酸基转移至DNA或RNA5'末端。

牛胰脱氧核糖核酸酶（DNaseI）嘧啶嘌呤嘧啶嘌呤蛇毒磷酸二酯酶4.影响限制性内切酶活性原因*DNA纯度DNA制备过程中污染：蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸（EDTA）、SDS（十二烷基硫酸钠）、高浓度盐离子等，都有可能抑制核酸内切限制酶活性。对策：①增加核酸内切限制酶用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多。

②扩大酶催化反应体积，以使潜在抑制原因被对应地稀释。

③延长酶催化反应保温时间。内切酶活力单位1U定义为37℃、1h内完全分解1μgλ-DNA所需酶量。

理论用量：1μgλ-DNA只需1U酶作用1h；实际用量：2U，2h样品含酶抑制剂，重新纯化限量用酶——非特异性核酸酶活性Dnase污染（活性需Mg2+，DNA储存缓冲液含EDTA）*DNA甲基化程度从大肠杆菌中分离质粒DNA通常混有：dam甲基化酶，G*ATC；dcm甲基化酶，C*CA/TGG基因克隆中使用失去了甲基化酶大肠杆菌菌株制备质粒DNA，防止被核酸内切限制酶局部消化，甚至完全不被消化。核酸内切限制酶不切割甲基化核苷酸序列应用：甲基化酶识别序列同一些限制酶识别序列相邻，抑制在这些位点发生切割作用，改变核酸内切限制酶识别序列特异性；经过甲基化作用将内部限制酶识别位点保护起来。*酶切消化反应温度

大多数核酸内切限制酶标准反应温度都是37℃，但也有许多例外情况，比如SmaⅠ是25℃、MaeⅠ是45℃。消化反应温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶活性，甚至最终造成完全失活。*DNA分子结构

DNA分子不一样构型对核酸内切限制酶活性也有很大影响。一些核酸内切限制酶切割超螺旋质粒DNA或病毒DNA所需要酶量，要比消化线性DNA高出许多倍，最高可达20倍。

另外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们自己处于不一样部位限制位点，其效率亦有显著差异。——位点偏爱（Sitepreference）位点偏爱（Sitepreference）

EcoRⅠ酶切割噬菌体中5个位点时不是随机，靠近右端位点比分子中间位点切割快10倍；EcoRⅠ和HindⅢ在噬菌体DNA中切割速率分别有10倍和14倍差异。噬菌体DNA有4个SacⅡ位点，三个在中央，一个在右臂，对中央三个位点酶切速度快50倍。

EcoRⅠ对腺病毒2DNA不一样位置切点切割速率也不一样。

*核酸内切限制酶缓冲液

核酸内切限制酶标准缓冲液组份包含氯化镁、氯化钠或氯化钾、Tris-HCL、β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）以及牛血清白蛋白（BSA）等。Mg2+作用是提供二价阳离子。缓冲液Tris-HCL使反应混合物pH恒定在酶活性所要求最正确数值范围之内。巯基试剂对于保持一些核酸内切限制酶稳定性是有用，而且还可保护其免于失活。不一样酶对离子强度要求差异很大，并依次将限制酶缓冲液按离子强度差异分为高、中、低三种类型，离子强度以NaCl来满足，浓度分别为100mM、50mM和0mM。NEBuffer1（黄色）：

10mMBisTris丙烷-HCl,10mMMgCl2,1mMDTT（pH7.0@25℃）。NEBuffer2（蓝色）：

10mMTris-HCl,10mMMgCl2,50mMNaCl,1mMDTT（pH7.9@25℃）。NEBuffer3（红色）：

50mMTris-HCl,10mMMgCl2,100mMNaCl,1mMDTT（pH7.9@25℃）。NEBuffer4（绿色）：

20mMTris-Ac,10mMMg(Ac)2,50mMKAc,1mMDTT（pH7.9@25℃）。宝生物企业缓冲液特殊缓冲液：NEBufferEcoRI：

50mMNaCl,100mMTris-HCl,10mMMgCl2,0.025%TritonX-100（pH7.5@25℃）双酶切缓冲液选择5.星星活性（staractivity）

在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相同序列，这个改变特殊性称星星活性。引发星星活性原因：甘油浓度高（>5%）；酶过量（>100U/l）；离子强度低（<25mM）；pH值过高（>8.0）；加入了有机溶剂如二甲基亚砜、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等；用其它二价阳离子如Mn2+、Cu2+、Co2+或Zn2+代替了Mg2+。不一样酶对上述条件敏感性不一样，如PstⅠ比EcoRⅠ对高pH更敏感，但后者对甘油浓度更敏感。二、构建物理图谱克隆载体构建物理图谱基本策略：将基因组DNA片段与载体整合进行克隆，取得重合克隆群。载体基本条件：自主复制原点，在宿主高效表示、稳定遗传；单克隆位点；筛选标识①质粒载体②柯斯质粒黏粒（cosmid）——人工构建含有λ噬菌体DNAcos序列和质粒复制子载体。cos序列是噬菌体DNA中将DNA包装到噬菌体颗粒中所需DNA序列。1978年Collins&Hohn等为克隆真核DNA大片段构建（质粒外源基因容量-10Kb）组成包含质粒复制起点（ColE1）、氨卡青霉素抗性标识、cos位点。黏粒特点含有λ噬菌体特征。黏粒在克隆了外源DNA在体外包装成噬菌体颗粒后，能够感染宿主菌并在细菌内按照λ噬菌体DNA方式环化起来。但黏粒载体不含有λ噬菌体全部必要基因，所以不会使宿主菌裂解，无法形成子代噬菌体颗粒。含有质粒特征。黏粒含有质粒复制子，可在宿主菌内像质粒DNA一样进行复制。克隆外源DNA容量大。黏粒本身相对较小，普通只有5～7kb，而最大克隆片段可达45kb左右。能与有同源序列质粒进行重组。黏粒克隆主要原理类似噬菌体载体。与外源片段连接时，粘粒载体相当于噬菌体载体左右臂，cos位点经粘端退火，与外源片段相间连接成多联体。多联体与噬菌体包装蛋白混合时，噬菌体A基因蛋白末端酶功效将切割两个cos位点，并将两个同方向cos位点之间片段包装到噬菌体颗粒。这些噬菌体颗粒感染大肠杆菌时，线状重组DNA如噬菌体DNA被注入细胞并经过cos位点环化，形成完整粘粒载体，可象质粒一样复制并使宿主取得抗药性。与噬菌体载体不一样，外源片段克隆在粘粒载体中以菌落形式表现出来，非噬菌斑。这种菌落总和组成基因文库。上述带有外源片段重组粘粒，可经过辅助噬菌体感染或诱导潜伏原噬菌体生长，重组粘粒cos位点可作为包装底物，造成重组粘粒DNA被包装到噬菌体颗粒中去。这些转导性颗粒从细胞中释放出来，既可无限期贮存，也可直接感染其它菌株。

③酵母人工染色体

（Yeastartificialchromosomes

YAC）利用酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）染色体复制元件构建载体。酿酒酵母形态为扁圆形和卵形，生长代时为90分钟；含16条染色体，其大小为225-1900kb，总计有14×106bp；具真核mRNA加工活性。

人工染色体必备结构元件自主复制序列（autonomouslyreplicationsequences，ARS）：含有酵母菌中DNA进行双向复制所必须信号；着丝粒（centromere，CEN）：负责染色体向子细胞传递；端粒（telomere，TEL）：对染色体DNA末端起保护作用。YAC载体——pYAC4

YAC载体工作原理YAC载体主要是用来构建大片段DNA文库（高等真核生物基因组文库），不用作常规基因克隆。BamHⅠ切割pYAC4形成微型酵母染色体，含染色体复制必要顺式元件，可携带酵母染色体大小DNA片段。BamHⅠ切割后形成微型酵母染色体，用EcoRⅠ或SmaⅠ切割抑制基因sup4内部位点形成染色体两条臂，与外源大片段DNA相连形成大型人工酵母染色体，转化进入酵母菌后可象染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中去，到达克隆大片段DNA目标。装载外源DNA片段重组子造成抑制基因sup4插入失活，形成红色菌落；载体自连形成白色菌落。装载不一样外源DNA片段红色重组酵母菌菌落群体就组成YAC文库。YAC文库装载DNA片段大小普通可达200-500kb，有可达1Mb以上，甚至到达2Mb。

YAC载体缺点存在嵌合现象，即一个YAC克隆中插入子可能来自两个或多个不一样片段（嵌合克隆约占总克隆5%～50%）。YAC克隆稳定性差，插入片段会出现缺失（deletion）和基因重（rearrangement）现象。YAC染色体与宿主细胞染色体大小相近，插入片段分离、纯化较困难，转化效率亦较低。缺失和插入重排（rearrangement）DNA分子内较大片段交换，称为重组或重排。

④细菌人工染色体（BAC）基于大肠杆菌F质粒构建，高通量低拷贝质粒载体。每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标识，一个起源于大肠杆菌F因子（致育因子）严谨型控制复制子oriS（Shizuyaetal.1992），一个易于DNA复制由ATP驱动解旋酶（（RepE）以及三个确保低拷贝质粒准确分配至子代细胞基因座（parA,parB,和parC）。BAC载体容量100-350Kb

F质粒

大肠杆菌F因子是一个约100kb质粒。编码60各种参加复制、分配和接合过程蛋白质（WillettsandSkurray，1987）。即使F因子通常以双链闭环DNA（1-2个拷贝/细胞）形式存在，但它能够在大肠杆菌染色体中最少30个位点处进行随机整合（Low，1987）。携带F因子细胞，或以游离状态或以整合状态表示三根发样状F菌毛。F菌毛为供体与受体细胞之间产生性接触所必需。第一代BAC载体（Shizuyaetal.1992）不含能用于区分携带重组子抗生素抗性细菌菌落与携带空载体细菌菌落标识物。新型BAC载体能够经过α互补原理筛选含有插入片段重组子，并设计了用于回收克隆DNANotⅠ酶切位点和用于克隆DNA测序Sp6开启子、T7开启子（Kimetal.1996;Asakawaetal.1997）。NotⅠ识别序列，位点十分稀少。重组子经过NotⅠ消化后，能够得到完整插入片段。Sp6、T7是起源于噬菌体开启子，用于插入片段末端测序。BAC载体空载时大小约7.5kb，在大肠杆菌中以质粒形式复制，含有一个氯霉素抗性基因。外源基因组DNA片段能够经过酶切、连接克隆到BAC载体多克隆位点上，经过电穿孔方法将连接产物导入大肠杆菌重组缺点型菌株。装载外源DNA后重组质粒经过氯霉素抗性和LacZ基因α–互补筛选。BAC载体优点以大肠杆菌为宿主，电转化，效率高BAC载体以超螺旋形式存在于大肠杆菌，提取方便；复制子源自F质粒，遗传稳定，嵌合、重组少；DNA单拷贝存在，适于传统菌落培养，可采取菌落原位杂交筛选目地基因；克隆位点两侧有T7和SP6开启子，可制备RNA探针或对插入片段测序。菌落原位杂交筛选目地基因E.coliRNA聚合酶结构

E.coli只有一个RNA聚合酶

全酶（holoenzyme）:

α2ββ′ωσ

(450kD)关键酶（coreenzyme）：α2ββ′ω

大肠杆菌RNA聚合酶全酶识别并结合于开启子三、基因组研究相关图谱遗传图谱物理图谱基因图谱序列图谱1.遗传图谱（geneticmap）/遗传连锁图/连锁图谱（linkagemap）以含有遗传多态性（在一个遗传位点上具一个以上等位基因，在群体中出现频率皆高于1%）遗传标识为“路标”，以遗传学距离（在减数分裂事件中两个位点之间进行交换、重组百分率，1%重组率称为1cM）为图距基因组图。6000多个遗传标识将人基因组分成6000多个区域，使连锁分析法能够找到某一致病或表现型基因与某一标识邻近（紧密连锁）而定位。是定位疾病基因和分析基因是个关键。

遗传图——基因定位遗传图谱DNA标识

第1代标识：经典遗传标识，以蛋白质或免疫学多态性位点为标识。——标识位点与所研究性状间连锁关系。ABO血型位点标识，HLA（人类白细胞抗原）位点标识。——已知多态性蛋白位点少，技术复杂、准确性差。70年代，限制性片段长度多态性（RFLP）：群体中不一样个体DNA序列仅有约1%差异——DNA多态性位点，酶切位点变异——（RFLP）。限制性片段长度多态性第2代标识

80年代，微卫星中心（minisatellitecore）、可变串联重复VNTR（variablenumberoftandemrepeats）提供不一样长度重复片段（6~12个核苷酸——1989年微卫星标识（microsatellitemarker）系统发觉和建立，结合PCR技术——简单序列长度多态性（simplesequencelengthpolymorphism，SSLP），扩增片段长度多态性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP）等。微卫星（microsatellite）标识微卫星又称为简单重复序列（simplesequencerepeat，SSR）。这种重复序列重复单位很短，经常只有2个、3个或4个核苷酸如一条染色体TCTGAGAGAGACGC另一染色TCTGAGAGAGAGAGAGAGACGC，就组成了多态性。第3代标识90年代，单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)：指染色体基因组水平上由单个核苷酸变异引发DNA序列多态性，含有分布广、密度高（人类基因组中每1000个核苷酸就有一个SNP）、多态性丰富等特点。

果蝇连锁图14号染色体遗传图谱上家系定位示意图

7号染色体上已定位遗传病

疾病基因确定2.物理图谱基因组DNA限制性酶切片段排列次序图酶切片段在DNA链上定位基因组中基因间次序显性化比遗传图谱分辨率更高是从遗传图到序列图中间图谱核苷酸序列不一样DNA，经酶切后产生不一样长度DNA片段，由此组成独特酶切图谱。

3.序列图谱

包含制备DNA片段化及碱基分析、DNA信息翻译多阶段过程。经过测序得到基因组序列图谱。大规模测序基本策略:

逐一克隆法：对连续克隆系中排定BAC克隆逐一进行亚克隆测序并进行组装（公共领域测序计划）。

全基因组鸟枪法：在一定作图信息基础上，不经大片段连续克隆系构建，直接将基因组分解成小片段随机测序，利用超级计算机进行组装（美国Celera企业）。

逐一克隆法鸟枪法4.基因图谱

在识别基因组所包含蛋白质编码序列基础上绘制结合相关基因序列、位置及表示模式等信息图谱。判别出全部基因位置、结构与功效，最主要方法是经过基因表示产物mRNA反追到染色体位置。能有效地反应在正常或受控条件中表示全基因组时空图。能够了解某一基因在不一样时间不一样组织、不一样水平表示；也能够了解一个组织中不一样时间、不一样基因中不一样水平表示，还能够了解某一特定时间、不一样组织中不一样基因不一样水平表示。

对基因转录表示产物mRNA互补cDNA（其片段称为表示序列标签，EST）进行大规模测序是序列标签位点主要起源，并以此构建人类基因组转录图（基因图）。AportionoftheE.colichromosomeshowinggenesandoperons.

Adotindicatesthepromoterforeachgeneoroperon.Arrowsandcolorindicatethedirectionoftranscribtion:darkbluegenesaretranscribedlefttoright,lightbluearetranscribedrighttoleft.Overlappinggeneareshowningreen.四、构建DNA物理图谱方法完整物理图谱包含：人类基因组不一样载体DNA克隆片段重合群图；大片段限制性内切酶切点图；DNA片段或异DNA序列（sequencetagssite，STS）路标图；基因组中广泛存在特征型序列（如CpG序列、Alu序列，isochore）等标识图。基本原理是把庞大无从下手DNA先“敲碎”，再拼接。以Mb、kb、bp作为图距，以DNA探针STS（sequencetagssite）序列为路标。主要方法限制性核酸内切酶降解法部分变性法DNA聚合酶法杂交电镜法（环形成法）末端标识法1.限制性核酸内切酶降解法部分酶解法交叉酶解法部分酶解法2个基本步骤完全降解：限制性内切酶将放射性标识DNA完全降解，经凝胶电泳分离后进行自显影，图谱显示组成该DNA链酶切片段数目和大小。部分降解：末端标识DNA一条链，以相同酶部分降解（控制反应条件使——酶量、温度、时间DNA链上该酶切口随机断裂），电泳分离及自显影。比较2个自显影图谱，依据片段大小及彼此间差异排出酶切片段在DNA链上位置——片那段重合。

一线性DNA片断长18.1kb，EcoRI完全消化后电泳，得8个片段，部分消化产生15个片断。完全消化片断：A(4.6),B(4.0),C(3.3),D(2.5),E(2.0),F(1.0),G(0.5),H(0.2)部分消化片断:

6.66.55.34.64.24.03.83.53.32.52.01.0

0.70.50.2部分消化大片断是完全消化小片断之和，可推测：6.6=2+4.6（E+A）；

6.5=2.5+4.0（D+B）；5.3=2+3.3（E+C）；3.8=0.5+3.3（G+C）；0.7=0.2+0.5（G+H）；4.2=0.2+4（B+H）或4.2=0.2+0.5+1.0+2.5（H+F+G+D）；3.5=1.0＋2.5（F+D）或3.5=0.2+3.3（H+C）

或3.5=0.5+1.0+2.0（G+F+E）AECGHFDB4.62.03.32.54.00.50.21.0EcoRI在此DNA片段上酶切图谱交叉酶解法AB2kb5kb3kbDNA片段总长3kbEcoRⅠ：1.7，0.9，0.4HpaⅡ：1.6，1.4EcoRⅠ+HpaⅡ：1.2,0.9,0.5,0.4HpaⅡ一个切点EcoRⅠ1.7kb片段不在末端-无0.2、0.1片段EcoRⅠ0.9和0.4kb都在末端→→2.部分变性法DNA分子各区域AT含量不一样，部分变性后，富含AT区出现电镜下可见环状结构。比较限制酶切DNA部分变性及全分子部分变性结果，确定酶切位点次序。richAT

richAT

3.末端标识法待测DNA片段5’或3’端先用32P标识；用某限制性内切酶部分酶解；电泳和放射自显影分析这一组酶解片段长度。各相邻片段长度之差就是二个相邻切点之间距离，也即它们之间片段大小。以足够数量限制性内切酶分别进行分析，对DNA片段作出比较详细物理图谱。

GFEDCBA－

*

A-G

*

A-F

A-EA-D*

A-C

*

A-B

*

A

*

＋

末端标识

*电泳凝胶上DNA片断判定人类部分染色体物理图谱TheE.coligenome五、核酸序列分析DNA一级结构测定

（DNAsequencing）

DNA一级结构:

多聚脱氧核苷酸链中脱氧核苷酸排列次序——碱基序列DNA碱基次序测定主要方法

1975年，Sanger加减法1977年，Sanger双脱氧终止法1977年，Maxam&Gilbert化学断裂法1.双脱氧法(dideoxymethod)或末端终止法(chaintermination)DNAsequencingwithchain-terminatinginhibitors.Sanger,F.,Nicklen,S.&Coulson,A.R.(1977).

ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,USA,74,5463-7.asecondNobelPrizeinChemistryin1980DNA生物合成参加DNA复制主要物质底物:

dATP,dGTP,dCTP,dTTP（dNTP）聚合酶:

DNA聚合酶（DNApolymerase）模板（template）:

解开成单链DNA母链引物（primer）:

互补于模板链寡核苷酸片段，

提供3-OH末端使dNTP能够依次聚合子链DNA延长方向:5’→3’DNA生物合成过程DNA聚合酶催化反应双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸掺入终止DNA链合成测序体系*****(1-5%)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测*****+–变性聚丙烯酰胺凝胶电泳丙烯酰胺+双丙烯酰胺→三维网状孔结构变性剂:尿素电泳装置放射自显影利用放射性同位素所发射出来带电粒子(α或β粒子)作用于感光材料卤化银晶体，从而产生潜影，这种潜影可用显影液显示，成为可见"像"。

2.自动测序HooddevelopedaprototypeautomatedDNAsequencerin1985Leroy

Hood(1938---)earnedanM.D.FromJohnsHopkinsUniversityin1964andaPh.D.inbiochemistryfromtheCaliforniaInstituteofTechnologyin1968.HewontheLemelson-MITPrizeforinventingfourinstruments:theDNAgenesequenceandsynthesizer,andtheproteinsynthesizerandsequencer

荧光物质作为标识物CCGAATGCTGACGTA荧光物质标识双脱氧核苷酸theSangerInstituteTeam55:SequencingFacility3.碱基序列测定新方法("Nextgeneration"methods)美国国家卫生研究院（NIH）设置“RevolutionaryGenomeSequencingTechnologies”基金，目标:20，测定一人全基因组序列只$10万，年，费用将降为$1000。Waston5月31日获赠装有他本人完整基因组图谱数据DVD光盘。（2个月，$200万）基因组学先锋J.CraigVenter、炎黄一号‘第一个中国人基因组图谱先后完成2008，首张非