川楝黄酮分离与结构研究

川楝黄酮分离与结构研究杨海艳，宋先亮﹡北京林业大学材料科学与技术学院，北京（100083）摘要：本文研究了用60%乙醇提取川楝黄酮，经萃取分离，聚酰胺层析柱纯化，用TLC法、颜色反应和紫外分光光度仪分析其黄酮成分。研究结果表明，川楝黄酮中含有两个黄酮醇类化合物，活性测试表明当浓度达到0.5g/L时，化合物Ⅰ对O2-·的清除率达为69.57%，对·0H的清除率为74.19%；化合物Ⅱ对O2-·的清除率为65.22%，对·0H的清除率为73.12关键字：川楝、黄酮、结构研究SeparationandIdentificationofFlavonoidsfromMeliatoosendanSieb.etZucc.YANGHai-yanSONGXian-liangCollegeofMaterialsScienceandTechnologyatBeijingForestryUniversity,Beijing(100083)Abstract:TheflavonoidsinfruitsofMeliatoowendanSieb.et.Zuccwasextractedby60%EtOH,separatedandpurifiedbyPolyamidechromatographicanalysiscolumn.TherearetwocompoundsidentifiedbyUV,TLCandcolourreactioninn-butylalcoholextractionsliquid,bothofthemareflavonolsandwithantioxidativeactivities.Thescavengingeffectonsuperoxideanionfreeradicalsis69.52%,whilethatonhydroxylfreeradicalsis74.19%atconcentrationofCompoundⅠ0.5g/L;Thescavengingeffectonsuperoxideanionfreeradicalsis65.22%,whilethatonhydroxylfreeradicalsis73.12%atconcentrationofCompoundⅡ0.Keywords:MeliatoosendanSieb.etZucc，flavonoids,structureresearch楝科植物川楝（MeliatoosendanSieb.etZucc.），又名金铃子，产于亚洲热带及亚热带地区，在我国主要产于四川、贵州、湖南、湖北等地。川楝含有川楝素、生物碱、山柰醇、树脂、鞣质等活性成分，在医学上的应用始载于《神农本草经》，其具有疏肝、止痛、驱虫等功效。其果实类球形，直径2～3cm，具深棕色小点，气特异，味酸、苦，主要药用成分为川楝子素、生物碱等，用于胸胁、脘腹胀痛、疝痛、虫积腹痛等症。此外，川楝子还被常用来治疗乳腺炎、乳腺增生等乳腺病。基金项目：北京林业大学大学生科研培训计划（200705010）作者简介：杨海艳（1986.5-），女，重庆市忠县人，北京林业大学材料科学与技术学院林产化学加工工程学生;E-mail:yhaiyan630@126.com通讯作者：宋先亮，副教授，博士，从事天然产物活性成分的提取分离及鉴定研究，E-mail:hdmsxl@黄酮类化合物的药用价值很高，具有强化免疫系统调节免疫功能、吸收活性自由基、具有抗癌、抗自由基氧化、抗衰老、抗病源微生物、抗炎症、抗感染、抗溃疡、抗痉挛、抗辐射、抗肿瘤、改善血液循环状态、促进组织再生、调节内分泌、减少黑色素生成、消除黄褐斑等多种功能[1，2]。研究发现，川楝总黄酮提取物具有较高的抗氧化活性，而其具体结构不清楚，本文对川楝总黄酮提取物进行分离，确定其结构[3]，有利于川楝的开发利用。1.实验部分1.1原料川楝子，采于四川省宜宾市林业局1.2仪器与主要试剂紫外分光光度计、硅胶板（50×100mm）、芦丁、无水乙醇、甲醇、甲醇钠、氯仿、石油醚Ⅱ（60-90）、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、冰醋酸、三氯化铝、氢氧化钠、盐酸、醋酸钠、硼酸、镁粉、锌粉、聚酰胺（60-90），试剂均为国产分析纯。1.3黄酮类化合物的提取川楝子去核,用体积浓度60%的乙醇,料液比1：20，70℃水浴提取1h，提取两次，合并提取液减压浓缩至膏状，加热水溶解浸膏，依次用石油醚萃取三次、乙醚萃取三次、乙酸乙酯萃取五次、正丁醇萃取三次，回收萃取剂。取正丁醇萃取物反复柱层析，层析柱为5cm×30cm开口柱，用梯度乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩结晶1.4结构鉴定1.4以正丁醇：冰醋酸：水=4：1：5作为展开剂，用硅胶板进行薄层层析，记录斑点紫外显色反应，计算Rf值。1.4样品溶液与HCl-Zn、HCl-Mg、10%NaOH、AlCl3、MgAc2、H2S046种颜色反应试剂反应后在可见光和紫外光下观察其颜色变化。1.4.用甲醇将样品溶解，在紫外分光光度计上于190-600nm范围分别测定“甲醇”谱图、“甲醇钠”谱图、“AlCl3”谱图、“AlCl3/HCl”谱图、“NaAc”谱图、“NaAc/H3BO3”1.5抗氧化活性的测定1.5.1对超氧阴离子自由基（O2-·）的清除借助一种简单的化学方法即利用过硫酸铵/N，N，Nˊ，Nˊ，-四甲基乙二胺体系产生O2-·与羟胺反应生成NO2-，经对氨基苯磺酸和α-萘胺显色在530nm处有特征吸收峰。AP-TEMED体系溶液的配制如下[4]：表1AP-TEMED体系溶液配制表Table1PreparationofAP-TEMEDsystem储存液成分加入量A:HCl(1mol/L);48.6%三羟甲基氨基甲烷（tris）366g/L;B:N,N,N,N,-四甲基乙二胺（TEMED）;0.23%过硫酸铵（AP）1.4g/L在25℃时，取A液0.4mL,B液1.6mL按体积比1:4混合反应1min,分别加入不同浓度的样品溶液1mL,再加入10mmol/L的盐酸羟胺0.4mL,混合反应20min,往各管加入17mmol/L对氨基苯磺酸2mL和7mmol/Lα-萘胺2mL,在25℃反应混合继续反应25min,反应后的显色溶液用同样体积的正丁醇充分摇匀,静置或离心分层,取正丁醇相测530nm处吸光值,以加1mL蒸馏水为对照样。清除率=（A-B）/A×100%，式中A为对照样A530值，B为不同浓度待测液A5301.5.2对羟自由基（·由Fenton体系产生羟自由基，并加入水杨酸进行有效捕捉，在510nm处有强吸收峰。若加入具有清除·0H的物质，便与水杨酸竞争使吸光值减少。在10mL比色皿中依次加入7.5mmol/L硫酸亚铁铵1mL，7.5mmol/L水杨酸1mL，0.1%H2021mL，tris-HCl缓冲液2mL,最后分别加入一定浓度的样品1mL,室温静置2h,在510nm处测其吸光值。清除率=（A-B）/A×100%，式中A为不加样品的A510值，B为不同浓度待测液A510值[3]。2.结果与讨论2.1TLC分析以正丁醇：冰醋酸：水=4：1：5为展开剂，作薄层层析，得到两个斑点，说明有两个化合物。化合物Ⅰ在254nm紫外光下显黄色，Rf=0.59；化合物Ⅱ在254nm在紫外光下显黄色，Rf=0.72。2.2颜色反应两种化合物与6种颜色反应试剂作用结果如下：表2颜色反应结果Table2Resultsofcolourreaction试剂HCl-ZnHCl-Mg10%NaOHAlCl3MgAc2H2SO4化合物Ⅰ紫红红黄黄绿黄黄化合物Ⅱ紫红红黄黄绿黄黄颜色反应结果表明，两种黄酮类化合物均为黄酮醇类化合物。2.3紫外光谱分析化合物Ⅰ：浅黄色粉末晶体，在紫外光下有两个特征吸收峰：364nm(Ⅰ)、268nm(Ⅱ)。在甲醇钠存在条件下，带Ⅰ红移55nm，说明有C4’-OH；在AlCl3及存在AlCl3/HCl存在条件下，带Ⅰ红移55nm、带Ⅱ红移8nm，说明有C5-OH和C3-OH存在；在NaAc存在条件下，带Ⅱ红移9nm,说明有C7-OH存在；在NaAc/H3BO3存在条件下，带Ⅰ红移32nm、带Ⅱ红移9nm，说明B环有邻二羟基存在，即分子中有C4’-OH和C化合物Ⅱ：黄色粉末晶体，在紫外光下有两个特征吸收峰：361nm(Ⅰ)、258nm(Ⅱ)。在甲醇钠存在条件下，带Ⅰ红移60nm，说明有C4’-OH；在AlCl3及AlCl3/HCl存在条件下，带Ⅰ红移63nm、带Ⅱ红移17nm，说明有C5-OH和C3-OH存在；在NaAc存在条件下，带Ⅱ无红移,说明没有C7-OH存在，或C7-OH被取代对紫外吸收的贡献消失；在NaAc/H3BO3存在条件下，带Ⅰ、Ⅱ通过上述分析结果得知，利用水浴提取川楝黄酮正丁醇萃取物中含有黄酮醇类化合物，其基本结构为：化合物Ⅰ化合物Ⅱ2.4抗氧化活性研究由图1可知，化合物Ⅰ对O2-·和·0H的清除率随浓度的增加而升高，当浓度达到0.5g/L时对O2-·的清除率达为69.57%，对·0H的清除率为74.19%；由图2可知，化合物Ⅱ对O2-·和·0H的清除率随浓度的增加而升高，当浓度达到0.5g/L时对O2-·的清除率为65.22%，对·0H的清除率为73.12(▲：O2-·；●：·0H)图1化合物Ⅰ质量浓度与O2-·和·0H图2化合物Ⅱ质量浓度与O2-·和·0H清除率的关系清除率的关系Fig.1EffectsofCompoundⅠonscavengingsFig.2EffectsofCompoundⅡonscavengingsO2-·and·0HO2-·and·0H3.结论3.1通过TLC法表明川楝子的提取液正丁醇萃取物中含有两个化合物。根据颜色反应表明两个化合物均为黄酮醇类化合物。3.2紫外分析结果表明化合物Ⅰ含有C4’-OH、C5-OH、C3-OH、C7-OH、邻二羟基（即C4’-OH和C3’-OH）；化合物Ⅱ含有C4’-OH、C5-OH、3.3利用过硫酸铵/N,N,N’,N’,-四甲基乙二胺体系产生超氧阴离子自由基，当质量浓度达到0.5g/L时，化合物Ⅰ对其清除率为69.57%；化合物Ⅱ对其清除率为3.4利用Fenton体系产生羟自由基，当质量浓度达0.5g/L时，化合物Ⅰ对其清除率为74.19%；化合