流式细胞仪在白血病免疫分型诊断的概述近年来白血病的免疫分

一、流式细胞仪在白血病免疫分型诊断的概述近年来白血病的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一APAAP方法基本被废弃。国际上公认的通用的方法是流式细胞术。流及其分化程度。流式细胞仪诊断白血病的依据⑴FCM能快速，多参数，客观的定性又定量测定细胞膜、浆、核的抗原表达⑵至今尚未发现白血病的特异抗原。⑶能用正常血细胞的单抗来进行免疫分型是基于白血病形成的分化阻断学说表达增多与减少甚至消失与血细胞的分化发育阶段密切相关流式细胞仪诊断白血病的意义一步深化，国际白血病MIC（ALL）或急性未分化白血病但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。③混合性白血病。④部分髓系白血病。目前CD7CD34达，预后不好。⑶疾病监测：可监测病程的发展，疗效，可进行微小残留白血病的检测。二、免疫分型常用的免疫标志及其意义白血病系列分化抗原T淋巴细胞白血病：CD3、CD5、CD7。B淋巴细胞白血病：CD10、CD19、CD22。NK淋巴细胞白血病：CD16、CD56、CD57。髓系白血病：CD13、CD14、CD33、MPO（髓过氧化物酶）。红白血病：GlyA（血型糖蛋白A）。巨核细胞白血病：CD41、CD42、CD61。白血病系列非特异性抗原CD34、HLA－DR为早期细胞抗原，无系列特异性，可与CD38联合运用于免疫分型。一般而言，干/祖细胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38－，原始细胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38＋，而幼稚细胞（如早幼粒细胞）CD34－、HLA－DR－、CD38＋。白血病分化阶段抗原T细胞抗原CD4、CD8。B细胞抗原：CD10、Cyμ（胞浆μ链）、SmIg（表面膜免疫球蛋白）、CD38和CyIg（胞浆免疫球蛋白）、CD11C。白细胞共同抗原CD45为白细胞共同抗原，其表达量在淋巴细胞最高，单核细胞，成熟粒细胞，早期造血细胞（）CD45。用SSC/CD45PerCPMcAb加CD45FSCSSCMcAbl-FITCMcAb2-PECD45PerCP五参数分析，可特异地分析原幼白血病细胞的免疫表型而不受成熟细胞的干扰。三、白血病及淋巴瘤免疫分型AMLMO：有低的SSC和FSC。在CD45－SSCCD13CD116MPOCD13CD33CD7CD4。一般HLA－DR、CD34CD7CD34共表达在AML：流式上M1M0CD13CD33HLA－DR－，但CD34M0，可能表达部分CD15。M2：M0与M1CD15M1CD34弱于M1，CD13有时表达强于CD33，多数病例HLA－DR（-）CD45－SSC图显示从髓系blastblastsM3、高颗粒性，具较高的SSC，但CD45较成熟C少，多数情况HLA－DR（-）或表达减少，CD34少于M2、一般CD13弱（＋），可有CD2表达。M4：两型表型相似，但M4M5表达更多的CD34（＋），较之M0M5FSSSSC，CD45－SSC图上，成熟CCD13、CD33、HLA－DR、CD14和CD15，CD33可表达强于CD13，CD33（＋）、CD13（－）、CD34（－）很可能为M5，但只出现在少数病人中，部分M5可见CD56（＋）。M6：M6较少见且特征不明显，一般HLA－DR，CD34、CD13、CD33阳性，CD45－SSC图显示主要为红系成份。M7：巨核细胞白血病，在AML1％。一般CD61（GpⅢa）/或CD41（GpⅡb-Ⅲa）blastsEDTA下，测GpⅡb/ⅢaCD34ALL：ALL是儿童中最常见的恶性肿瘤2ALL约占急性白血病的我们将ALL分为BCD10＋或CD10－，前BB祖细胞型ALL：在幼儿约占ALL55％～60％，成人为50％90％病例CD1050％病例CD10＋，blastsFSCSSC很少，是FAB标准的L1L2，一般TdT(+)HLA-DR(+)，CD19(+2CD10－，前者预祖细胞被定义为sIgBALL：此♘型约占儿童ALL的25％，细胞一般为CD19＋，CD24，HLA－DR＋，胞浆CD22＋，CD10CD20多为阴性，前B♘型被认为比B出现相关并由此产生E2A－PBX1融合蛋白，它的表型为CD19CD10CD9CD20CD34－，确认此表型有助于诊断基因上不确定的病例。B细胞型ALL：成熟B细胞型ALL约占ALL％～B细胞型ALL较之B祖细胞型ALL有更大的FSC和SSC，CD45－SSCFAB标准的CD19CD20CD22CD24CD10sIg使之区别于更早的B极少数成熟BALLFAB－L3T－ALL：多数病例有大的FSC、SSC，在CD45－SSC图上可能出现在淋系未成熟细胞和髓系、CD5、CD7CD4/CD8双阳与极少膜表面CD3TdTCD7、TdT强表达。髓质期♘型表达CD2、CD5、CD7、与CD3＋CD4＋/CD3+CD8+,很少见TdT表达。前T细胞♘型，表达CD7胞浆CD3＋且无其它T特征是丧失T杂合型白血病：病人多为BTCD22CD3MPO。CML：CD45－SSC髓像，CMLCML起病与发展相对缓慢，慢性期的持续1急变期CML主要表现为髓系，偶为淋系，髓性急变可表现出多种形态包括未分化细胞。淋性急变具典型形态特征，为CD10＋B祖细胞ALL极少有T细胞型ALL。CLL：CLL、SIgD弱表达，B系抗原为CD19CD20CD43CD79aCD5表达使得CLLMU，即（CLL：CD23＋，MCL：CD23－），CD10CD23CD11c和CD25、CD20达，尽管CLL起病慢，但CLL的三联体trisony12、、13q、11q，免疫表型上没有特异的变化而免疫表型的变化并不是提示染色体异常。最近，有研究表明，三联体trisony12与SIg、CD20表达量高度相关，CD23FMC7B较CLLB－DLLCLL发挥很大作用，B－DLLCD5－，CD22＋，表达更强的sig。MU病人平均生存率不超过5年，与CLL在形态上很难区分，与CLL相似有CD5＋B祖细胞，但Sig表达强于CLL，且CD22－。另一与CLL难于区分的是FCC，细胞为强Sig、CD5－、CD10＋、CD23＋，具B系表型：对于诊断为CLL，CD5、FMC7、CD22与SIg，CD20异常强表表达的病例我们要考虑是否为DLL、MCC或CLL的♘型（trisomy12）因为它们危险性更大。四、流式细胞仪免疫分型实验样本采集、运输、保存和操作⑴样本类型：适用于多种临床标本，如外周血、骨髓穿刺液、骨髓活检物、淋巴样组织活检物、浆液、脑脊液、皮肤、黏膜（内窥镜活检物）、细针穿刺物等等。EDTAACD计数和流式分析，则应用EDTA抗凝。骨髓穿刺可用肝素。其他体液用EDTAACD或肝素均可，但保存的样本活性可能会降低，的优点是成熟髓性细胞贴壁造成的损失及血小板聚集较小，但细胞散射光特征丢失较肝素标本快；由于相对大量的ACD会通过改变pH而影响骨髓细胞活性问题，通常不推荐用ACD⑶样本的保存：样本的完整性和细胞活性与抗凝剂的选择、运输、保存和温度息息相关。①理想状态下，样本应在采集后立刻进行处理和染色。②短期保存（1小时或更短）应在室温(18-22℃);③长时间保存血或骨髓标本室温即可，有些样本可能4℃为佳。④标本保存的时间上限取决于标本类型及其保存条件。⑤肝素抗凝的血和骨髓通常可保存至48-72小时；⑥EDTA抗凝的血和骨髓可保存至12－24小时。⑦ACD抗凝的血和骨髓可保存至72小时，但?quot要分析的抗原特性和染色方式，采用之前一定要进行新鲜标本的对照和验证实验。样本制备⑴单细胞悬液的制备①血和骨髓：天然单细胞悬液。当有血凝块时，应用50um尼龙网过滤，同时进行细胞计数和血涂片以判断靶细胞群体是否仍然存在。⑵分离靶细胞群体样本的任何处理方式都可能导致靶细胞群体的丢失的处理过程。去除红细胞是流式分析要求的至少步骤。两种方法：①红细胞裂解：较佳。操作简单、快、并最可能保持原始标本的白细胞分布。溶血剂的选择应基于其选择性去除成熟红细胞而最小程度的影响其他细胞的特点。最好在染色后溶血。若在染色前溶血，需确认：抗原性不被溶血过程改变；溶血剂被彻底洗去，细胞和抗体结合的动力反应未受影响；所用溶血剂不含固定剂，否则会影响细胞活性及表面标记结果。⑶估细胞悬液变，应弃用。②细胞丢失和分布：确认细胞形态和原始标本相似。密度梯度离心之后更应检查细胞分布。可做血涂片判断。③细胞计数和浓度调整：厂家推荐的抗体浓度通常是假定靶细胞数量在正常范围内(500,000-1,000,000／testAb)。白细胞数量上的显著变化会带来染色模式的变化。而白血WBC<1000/uL:用200uLWBC:1000-10000/uL,100uLWBC:10000-20000/uL,50uL量；WBC>20000/uL(2)(3)范围内。骨髓标本常常要在PBS1:10（如自己稀释抗体④细胞活性：死细胞对许多抗体有非特异性染色，有些抗原同时存在于胞膜和胞浆，这就使样本的细胞活性检测变得重要尤其毖揪 顺な奔涞脑耸浜痛⒋妫蚨匝镜闹谱鞴滩惶宄薄＜觳獾姆椒ㄍǔＳ辛街郑阂皇鞘凳钡牧魇郊觳猓豪糜馊玖螾I7-AAD或EMA（ethidium。活细胞将拒染这些染料。此方法的优势是细胞表面标志和性分析可同时进行通过设门即可得到活细胞的染色特性尤其适用于高度坏死的样本样本染色后需固定。应在加固定剂之前洗去多余的7AAD，以保证区分的是固定前细胞的死活状态。但随着时间延长会在固定的细胞群体重新分配，死活细胞的区分变难。对于染色后常规固定并在固定后12小时以上分析的标本最好用EMAEMA与死细胞DNA稳定的共价结合保证了长时间固定后仍能很好地区分固定前的死活状态。二是手工检测：使用Trypanblue或其他细胞活性染料。⑷细胞染色②细胞内染色：有些胞内特异性抗原的检测对白血病的免疫分型尤为重要，如TdT,MPO,cCD3,cCD22,以及胞浆内Ig抗体组合的确定：估和分类。确认细胞异常的能力与所用抗体的数量直接成正比。⑴选择抗体组合的基本原则如下：1）达比例也更准确。如现在用CD45抗体来区分正常和幼稚细胞，此方法尤其在幼稚细胞含量少时更显优势。3）4）必要时用活性检测排除死细胞较强的非特异性染色。国外统计，约70%组织样本和48%血或骨髓标本有活性检测结果。5）CD⑵常用的方案考虑：大而全的抗体组合：全面了解抗原表达，无需额外染色，省时但费用高30%国外实验室采用此法。基于临床或形态学的资料，选用有目标性的抗体组合以确认可疑的诊断或分类。样本获取1-2x104256数据分析味着综合细胞的光散射和多色荧光特征。最少的要求应是42参数）。采用的参数越多，分析步骤越复杂，流式免疫分型的灵敏度越高。原则是要用多参数的数据创造可以区分正常和异常细胞的图形，如FSCvs.SSC,FLvs.FL,Scattervs.FL细胞则通过进一步设门分析确定表型特点。FSCvs.SSCL&LSSCBBκ链和抗λT细胞淋巴瘤时用一个全T细胞抗体设门使肿瘤细胞的分型更加明确。另外，通过细胞特异的"backgateCD14vs.CD45意：①在L&L中，定性的描述（阳性或阴性）通常要比阳性百分率的计算更有价值。只有在设门内细胞全部是感兴趣的细胞而且荧光分布的形状可以非常清楚地区分阳性和阴性♘群的分析（X%幼稚细胞CDX）；百分率也可用于描述异常和正常细胞的比例。CD4CD8或CD38CD22或CD4等抗原则在所谓阳性范围内在不同细胞类型上的区别较小。③区分弱阳性和阴性群体：在某些情况下对诊断有较大的价值，如B细胞恶性肿瘤的CD5"20直方图上与对照组相比向右移动来判断阳性所需的最小位移也是人为的标准K-S统计判断弱阳性染色的特异与否。数据解释虽然对流式免疫分型结果的解释最好与形态学结果综合考虑甚至在一些典型表现下流式免疫分型可以在其他方法的辅助下诊断疾病附：白血病免疫分型的结果图Table1.CellularmarkersusefulintheidentificationandclassificationofacuteleukemiaCoreCoreCD2,CD5,CD7,CD10,CD13,CD14,CD19,CD33,CD34,CD45,HLA-DR,KAPPA,LAMBDASupplementalCD1a,s/cytoplCD3,CD4,CD8,CD20,s/cytoplCD22,CD38,CD61,CD71,MPO,TdTTable2.CellularmarkersusefulintheidentificationandclassificationoflymphoproliferativediseaseBloodandBoneMarrowBloodandBoneMarrowTissueandBodyFluidCoreCD3,CD4,CD5,CD7,CD8,CD5,CD10,CD19,CD20,CD23,CD45,CD10,CD19,CD20,CD45,KAPPA,LAMBDAKAPPA,LAMBDASupplementalCD2,CD11c,CD16,CD22,CD2,CD3,CD4,CD7,CD8,CD11c,CD13,CD23,CD25,CD56,CD57,CD16,CD22,CD33,CD38,FMC7,CD38,FMC7 CD57,IgM,IgD,IgG,IgAUsefulcombinationsUsefulcombinationsPopulationstobeUsefulcombinationsUsefulcombinationsPopulationstobeidentifiedUsefultargetsfor2-colorfor3-colorImmatureBcellsNormalorClonalBcellsCD19,CD20,Kappa,LambdaCD19(CD20)/K,CD19(CD20)/LCD19(CD20)/K/LCD19,CD20,BcellofCLLvsCD23,lymphoproliferativedisordersCD22,FMC7,CD11c,CD103,CD10CD20/5,CD23/FMC7,CD5/3/20,CD5/K/L,CD19(20)/11c,CD19/11c/103,CD19(20)/103,CD19/23/FMC7CD19(20)/10PlasmacellsCD38,Cytkappa,Cytlambda,BB4,CD56CD38/Cytkappa,CD38/CytlambdaCD38/56/45,CD38/45/CytkappaCD38/45/CytlambdaImmatureTcellsCD1,CD4,CD34,CD8,CD7,cytCD3,CD2,CD1a,TdTCD1a/2,CD2/7,CD4/8CD7/1a/2analysisanalysisCD19,CD10,CD34,CD20,CD19/10;CD20/10;CD19/10/34;CD79a,CD22,CD45,TdTCD34/22;CD45/19CD19/79a/10NormalorabnormalTcells

CD3,CD5,CD7,CD3/4,CD2,