生物化学课件 基因重组和基因工程

GeneticRecombinationandGeneticEngineering第十四章基因重组和基因工程1GeneticRecombinationandGe第一节自然界DNA重组和基因转移2第一节自然界DNA重组和基因转移2接合作用(conjugation)转化作用(transformation)转导作用(transduction)一、细菌的基因转移与重组3接合作用(conjugation)转化作用(transf（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。4（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒D55质粒——

细菌染色体外的小型环状双链DNA分子6质粒——细菌染色体外的小型环状双链DNA分子6可接合质粒如F因子(Ffactor)

7可接合质粒如F因子(Ffactor)7（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。

8（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。9例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。91010（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。11（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染λ噬菌体的生活史溶菌生长途径(lysispathway)溶源菌生长途径(lysogenicpathway)例12λ噬菌体的生活史溶菌生长途径例121313（四）、转座由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。14（四）、转座由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座插入序列(insertionsequences,IS)组成：二个分离的反向重复(invertedrepeats,IR)序列特有的正向重复序列一个转座酶（transposase)编码基因

IRTransposaseGeneIR发生形式：保守性转座(conservativetransposition)复制性转座(duplicativetransposition)（一）插入序列转座15插入序列(insertionsequences,IS)组插入序列的复制性转座16插入序列的复制性转座16转座子(transposons)——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。

转座子组成：反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposaseGene有用基因（二）转座子转座17转座子(transposons)——可从一个染色体位点转移由转座子介导的转座18由转座子介导的转座18在接合、转化、转导或转座过程中，不同DNA分子间发生的共价连接称基因重组。二、基因重组同源重组

(homologousrecombination)位点特异的重组(site-specificrecombination)19在接合、转化、转导或转座过程中，不同DNA分子间发生的共价连一、同源重组(homologousrecombination)

发生在同源序列间的重组称为同源重组，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。20一、同源重组(homologousrecombinati2121以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。22以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的HollidHolliday模型中，同源重组主要4个关键步骤①两个同源染色体DNA排列整齐②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体③通过分支移动产生异源双链DNA④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)

23Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤①两个同源片段重组体（见模型图左边产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体（见模型图右边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。24片段重组体（见模型图左边产物）：拼接重组体（见模型图右边

内切酶

(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移

(recA)

内切酶(recBCD)

DNA

连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´25内切酶DNA侵扰分支迁移内切酶DNA5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶片段重组体拼接重组体26Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´二、位点特异重组位点特异重组(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。27二、位点特异重组27设想一能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？能否让细菌“吐出”蚕丝？设想二能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？设想三科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术——基因工程。定向基因改造设想28设想一能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？能否让细菌“吐基因工程的原理操作环境操作对象操作水平基本过程结果生物体外基因(或DNA片段）DNA水平剪切→拼接→导入→表达人类需要的新的生物类型基因产物基因重组DNA重组技术是基因工程的核心技术29基因工程的操作环境操作对象操作水平基本过程结果生物体外基因重组DNA技术的发展史年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉30重组DNA技术的发展史年G.J.Mendel的豌豆杂交试第二节

重组DNA技术DNARecombinationTechnique31第二节

重组DNA技术DNARecombinat一、重组DNA技术相关概念克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。克隆化(cloning)获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。（一）DNA克隆32一、重组DNA技术相关概念克隆(cl(1)分子克隆(molecularclone),即DNA克隆

(2)细胞克隆；(3)个体克隆（动物或植物）。

重组水平:33(1)分子克隆(molecularclone),即DNADNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)

。

34DNA克隆341.目的基因的获取2.克隆载体的选择与构建3.外源基因与载体的连接4.重组DNA导入受体菌5.重组体的筛选6.克隆基因的表达二、重组DNA技术基本过程351.目的基因的获取二、重组DNA技术基本过程35基因工程的工具酶

限制性核酸内切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆转录酶

T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶

TaqDNA聚合酶36基因工程的工具酶限制性核酸内切酶36限制性核酸内切酶“分子手术刀”限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制酶Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。37限制性核酸内切酶“分子手术刀”限制性核酸内切酶(r作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。38作用38细菌的限制性核酸内切酶DNA普通内切酶DNA细菌限制性内切酶GAATTCCTTAAG在特定部位实施内切。粘性末端被核酸外切酶降解细菌自身DNA甲基保护GAATTCCTTAAGCH3CH3不工作这种限制性核酸内切酶有何用呢？打击入侵的敌人39细菌的限制性核酸内切酶DNA普通内切酶DNA细菌限制性内切酶噬菌体入侵噬菌体DNA若专一序列点无甲基保护，将被降解。40噬菌体入侵噬菌体DNA若专一序列点无甲基保护，将被降解。40第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名EcoRⅠ

属

种

株

序Escherichiacoli

RY13株大肠杆菌RY13株的第一种酶41第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；命名EcoRⅠ第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。HindⅢ

属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶42第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；HindⅢ分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）已经发现和鉴定了200多种43分类已经发现和鉴定了200多种43Ⅱ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG44Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口45BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC

被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。黏性末端46被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，EnzymesinvolvedinDNAcloning

Restrictionendonucleases(II)

EcolRⅠPstⅠSmalⅠ47EnzymesinvolvedinDNAclonin同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ48同功异源酶GGATCCGGATCC+BamHⅠGGATCC同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA49同尾酶BamHⅠBglⅡGGATCCAGATCTG重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基50重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功1、目的基因cDNA(complementaryDNA)

体外反转录合成的、与mRNA互补的DNA基因组DNA(genomicDNA)

代表一个细胞/生物体整套遗传信息的所有DNA序列（一）目的基因的获取511、目的基因cDNA(complementaryDNA)1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)

2、目的基因的获取方法521.化学合成法2、目的基因的获取方法52*化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列53*化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序分子文库基本策略

54分子文库基本策略

545555变性、退火、延伸三步曲变性：双链DNA解链成为单链DNA退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链PCR的基本反应步骤：56变性、退火、延伸三步曲变性：双链DNA解链成为单链DNAPC2、克隆载体的选择与构建基因载体：是运送目的基因片段进入宿主细胞的DNA分子，——“分子运输车”。572、克隆载体的选择与构建基因载体：是运送目的基因片段进入宿主（1）能够自我复制，并带动插入的外源基因一起复制（2）具有合适的限制性酶切位点（多克隆位点，外源DNA插入点）（3）具有合适的筛选标记（4）细胞内拷贝数要多（5）载体的分子量要小，以容纳较大的外源DNA。（6）细胞内稳定性高作为运载体必须具备哪些条件？常用的载体：细菌质粒、l噬菌体、cosmid质粒等。58（1）能够自我复制，并带动插入的外源基因一起复制作为运载体必

质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。1.质粒

(plasmid)59质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的环状DN质粒载体

的一般结构60质粒载体

的一般结构60λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体(phage)

M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列61λ噬菌体DNA改造系统2.噬菌体(phage)M13噬3.粘性质粒(cosmid)623.粘性质粒(cosmid)62酵母人工染色体

(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体

(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他63酵母人工染色体其他63克隆载体(cloningvector)

用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变表达载体(expressionvector)

在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物载体类型根据具体实验需要选择载体64克隆载体(cloningvector)载体类型根据具体实验6565（三）外源基因与载体切割与连接催化连接反应的酶：DNA连接酶66（三）外源基因与载体切割与连接催化连接反应的酶：DNA连接酶DNA连接酶使一段DNA的3’-羟基末端与另一段DNA的5’-磷酸末端生成3’，5’-磷酸二酯键，使单链DNA缺口封合或使两个DNA片断连接成一个片断——“分子缝合针”67DNA连接酶使一段DNA的3’-羟基末端与另一段DNA的5’根据酶的来源不同，分为两类：1.E.coliDNA连接酶：大肠杆菌，只能连接互补的粘性末端。2.T4连接酶：T4噬菌体，既可以“缝合”双链DNA片段互补的粘性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。68根据酶的来源不同，分为两类：68方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接1.粘性末端连接69方式：(1)同一限制酶切位点连接1.粘性末端连接69BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接70BamHⅠ切割反应GGATCCT4DNA连接酶GATC不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。71不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg2.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端722.平端连接72目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连73目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶重组体3.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。743.同聚物加尾连接745´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´

3´3´5´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体755´3´载体DNA5´3´目的基因限制酶或机械剪切限制酶4.人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

764.人工接头(linker)连接76人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ77人工接头及其应用CCGAATTCG5´-EcoRⅠEco受体菌条件安全宿主菌：防止感染限制酶和重组酶缺陷：避免修饰、降解和重组整合处于感受态(competent)

（四）重组DNA导入受体菌78受体菌条件（四）重组DNA导入受体菌78大肠杆菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞宿主菌或受体细胞感受态细胞（competentcell）79大肠杆菌宿主菌或受体细胞感受态细胞（competentc导入方式转化(transformation)：大肠杆菌转染(transfection)：真核细胞感染(infection)（转导）：病毒80导入方式80CaCl2处理受体细菌0.1MCaCl2

感受态细菌重组体转入细菌容易接受外源DNA的状态感受态细胞81CaCl2处理受体细菌0.1MCaCl2感受态细菌重组体8282

(1)

抗药性标记选择

(2)标志补救(markerrescue)核酸杂交筛选法

原位杂交

Southern印迹PCR/DNA序列鉴定外源基因表达产物鉴定：SDS、Westernblot、ELISA、放免、免疫沉淀、荧光抗体等遗传标志筛选法（五）重组体的筛选83(1)抗药性标记选择核酸杂交筛选法遗传标(插入失活法)抗药性标记选择84(插入失活法)842）标志补救（ß-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段852）标志补救（ß-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COX-galLacZ蓝色化合物X-gal86X-galLacZ蓝色化合物X-gal86α互补的检测87α互补的检测878888原位杂交89原位杂交89Southern印迹纪念发明者EdwardSouthern（1）提取总DNA（2）酶解（3）电泳（4）转移到滤膜（5）变性解链（6）DNA探针及杂交（7）洗脱（8）放射自显影（9）比较分析90Southern印迹纪念发明者EdwardSouthern9191琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段：磷酸基团带负电荷酶解片段向阳极移动电场驱动力和凝胶阻力

——不同迁移率分子量标准参照物

酶切和电泳方法92琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段：酶切和电泳方法凝胶电泳检测加样孔DNAMarker空质粒重组质粒

重组质粒酶切重组质粒的PCR扩增片段93凝胶电泳检测加样孔DNAMarker空质粒重组质粒9494分：分离目的基因切：对目的基因和载体适当切割接：目的基因与载体连接转：重组DNA转入受体菌筛：筛选出含有重组体的受菌体DNA克隆的基本过程小结95分：分离目的基因DNA克隆的基本过程小结95重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交96重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源表达体系的建立表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达97表达体系的建立（六）克隆基因的表达971.原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）标准：选择标志 强启动子翻译调控序列 多接头克隆位点E.coli表达体系的不足

不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusionbody)

很难表达大量可溶性蛋白981.原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）98优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、不经济转染

——

将表达载体导入真核细胞的过程方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔脂质体转染显微注射

2.真核表达体系

酵母、昆虫、乳类动物细胞99优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA转染——将表表达载体pFASTBACI的物理图谱100表达载体pFASTBACI的物理图谱100101101三、重组技术与医学的关系疾病相关基因分析制造生物活性蛋白质基因诊断与基因治疗遗传疾病的预防102三、重组技术与医学的关系疾病相关基因分析102

重组DNA医药产品产品功能组织胞浆素原激活剂抗凝血液因子VIII促进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化生长素治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶抗组织损伤单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗(CHO,酵母)预防乙肝口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱103重组DNA医药产品产品功能组织胞浆素原激基因治疗基因治疗(genetherapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。104基因治疗104重症联合性免疫缺陷综合症（SCIDs）。腺苷脱氨酶（ADA）105重症联合性免疫缺陷综合症（SCIDs）。腺苷脱氨酶（ADA1.产前诊断2.携带者测试3.症候前诊断4.遗传病易感性遗传疾病的预防1061.产前诊断遗传疾病的预防106小结基本概念：限制性核酸内切酶基因工程的基本过程：分，切，接，转，筛，表达理想质粒载体的特点107小结基本概念：限制性核酸内切酶107

GeneticRecombinationandGeneticEngineering第十四章基因重组和基因工程108GeneticRecombinationandGe第一节自然界DNA重组和基因转移109第一节自然界DNA重组和基因转移2接合作用(conjugation)转化作用(transformation)转导作用(transduction)一、细菌的基因转移与重组110接合作用(conjugation)转化作用(transf（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。111（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒D1125质粒——

细菌染色体外的小型环状双链DNA分子113质粒——细菌染色体外的小型环状双链DNA分子6可接合质粒如F因子(Ffactor)

114可接合质粒如F因子(Ffactor)7（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。

115（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。116例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。911710（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。118（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染λ噬菌体的生活史溶菌生长途径(lysispathway)溶源菌生长途径(lysogenicpathway)例119λ噬菌体的生活史溶菌生长途径例1212013（四）、转座由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。121（四）、转座由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座插入序列(insertionsequences,IS)组成：二个分离的反向重复(invertedrepeats,IR)序列特有的正向重复序列一个转座酶（transposase)编码基因

IRTransposaseGeneIR发生形式：保守性转座(conservativetransposition)复制性转座(duplicativetransposition)（一）插入序列转座122插入序列(insertionsequences,IS)组插入序列的复制性转座123插入序列的复制性转座16转座子(transposons)——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。

转座子组成：反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposaseGene有用基因（二）转座子转座124转座子(transposons)——可从一个染色体位点转移由转座子介导的转座125由转座子介导的转座18在接合、转化、转导或转座过程中，不同DNA分子间发生的共价连接称基因重组。二、基因重组同源重组

(homologousrecombination)位点特异的重组(site-specificrecombination)126在接合、转化、转导或转座过程中，不同DNA分子间发生的共价连一、同源重组(homologousrecombination)

发生在同源序列间的重组称为同源重组，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。127一、同源重组(homologousrecombinati12821以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。129以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的HollidHolliday模型中，同源重组主要4个关键步骤①两个同源染色体DNA排列整齐②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体③通过分支移动产生异源双链DNA④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)

130Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤①两个同源片段重组体（见模型图左边产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体（见模型图右边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。131片段重组体（见模型图左边产物）：拼接重组体（见模型图右边

内切酶

(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移

(recA)

内切酶(recBCD)

DNA

连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´132内切酶DNA侵扰分支迁移内切酶DNA5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶片段重组体拼接重组体133Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´二、位点特异重组位点特异重组(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。134二、位点特异重组27设想一能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？能否让细菌“吐出”蚕丝？设想二能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？设想三科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术——基因工程。定向基因改造设想135设想一能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？能否让细菌“吐基因工程的原理操作环境操作对象操作水平基本过程结果生物体外基因(或DNA片段）DNA水平剪切→拼接→导入→表达人类需要的新的生物类型基因产物基因重组DNA重组技术是基因工程的核心技术136基因工程的操作环境操作对象操作水平基本过程结果生物体外基因重组DNA技术的发展史年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉137重组DNA技术的发展史年G.J.Mendel的豌豆杂交试第二节

重组DNA技术DNARecombinationTechnique138第二节

重组DNA技术DNARecombinat一、重组DNA技术相关概念克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。克隆化(cloning)获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。（一）DNA克隆139一、重组DNA技术相关概念克隆(cl(1)分子克隆(molecularclone),即DNA克隆

(2)细胞克隆；(3)个体克隆（动物或植物）。

重组水平:140(1)分子克隆(molecularclone),即DNADNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)

。

141DNA克隆341.目的基因的获取2.克隆载体的选择与构建3.外源基因与载体的连接4.重组DNA导入受体菌5.重组体的筛选6.克隆基因的表达二、重组DNA技术基本过程1421.目的基因的获取二、重组DNA技术基本过程35基因工程的工具酶

限制性核酸内切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆转录酶

T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶

TaqDNA聚合酶143基因工程的工具酶限制性核酸内切酶36限制性核酸内切酶“分子手术刀”限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制酶Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。144限制性核酸内切酶“分子手术刀”限制性核酸内切酶(r作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。145作用38细菌的限制性核酸内切酶DNA普通内切酶DNA细菌限制性内切酶GAATTCCTTAAG在特定部位实施内切。粘性末端被核酸外切酶降解细菌自身DNA甲基保护GAATTCCTTAAGCH3CH3不工作这种限制性核酸内切酶有何用呢？打击入侵的敌人146细菌的限制性核酸内切酶DNA普通内切酶DNA细菌限制性内切酶噬菌体入侵噬菌体DNA若专一序列点无甲基保护，将被降解。147噬菌体入侵噬菌体DNA若专一序列点无甲基保护，将被降解。40第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名EcoRⅠ

属

种

株

序Escherichiacoli

RY13株大肠杆菌RY13株的第一种酶148第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；命名EcoRⅠ第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。HindⅢ

属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶149第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；HindⅢ分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）已经发现和鉴定了200多种150分类已经发现和鉴定了200多种43Ⅱ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG151Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口152BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTC

被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。黏性末端153被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，EnzymesinvolvedinDNAcloning

Restrictionendonucleases(II)

EcolRⅠPstⅠSmalⅠ154EnzymesinvolvedinDNAclonin同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ155同功异源酶GGATCCGGATCC+BamHⅠGGATCC同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA156同尾酶BamHⅠBglⅡGGATCCAGATCTG重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基157重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功1、目的基因cDNA(complementaryDNA)

体外反转录合成的、与mRNA互补的DNA基因组DNA(genomicDNA)

代表一个细胞/生物体整套遗传信息的所有DNA序列（一）目的基因的获取1581、目的基因cDNA(complementaryDNA)1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)

2、目的基因的获取方法1591.化学合成法2、目的基因的获取方法52*化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列160*化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序分子文库基本策略

161分子文库基本策略

5416255变性、退火、延伸三步曲变性：双链DNA解链成为单链DNA退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链PCR的基本反应步骤：163变性、退火、延伸三步曲变性：双链DNA解链成为单链DNAPC2、克隆载体的选择与构建基因载体：是运送目的基因片段进入宿主细胞的DNA分子，——“分子运输车”。1642、克隆载体的选择与构建基因载体：是运送目的基因片段进入宿主（1）能够自我复制，并带动插入的外源基因一起复制（2）具有合适的限制性酶切位点（多克隆位点，外源DNA插入点）（3）具有合适的筛选标记（4）细胞内拷贝数要多（5）载体的分子量要小，以容纳较大的外源DNA。（6）细胞内稳定性高作为运载体必须具备哪些条件？常用的载体：细菌质粒、l噬菌体、cosmid质粒等。165（1）能够自我复制，并带动插入的外源基因一起复制作为运载体必

质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。1.质粒

(plasmid)166质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的环状DN质粒载体

的一般结构167质粒载体

的一般结构60λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体(phage)

M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列168λ噬菌体DNA改造系统2.噬菌体(phage)M13噬3.粘性质粒(cosmid)1693.粘性质粒(cosmid)62酵母人工染色体

(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体

(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他170酵母人工染色体其他63克隆载体(cloningvector)

用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变表达载体(expressionvector)

在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物载体类型根据具体实验需要选择载体171克隆载体(cloningvector)载体类型根据具体实验17265（三）外源基因与载体切割与连接催化连接反应的酶：DNA连接酶173（三）外源基因与载体切割与连接催化连接反应的酶：DNA连接酶DNA连接酶使一段DNA的3’-羟基末端与另一段DNA的5’-磷酸末端生成3’，5’-磷酸二酯键，使单链DNA缺口封合或使两个DNA片断连接成一个片断——“分子缝合针”174DNA连接酶使一段DNA的3’-羟基末端与另一段DNA的5’根据酶的来源不同，分为两类：1.E.coliDNA连接酶：大肠杆菌，只能连接互补的粘性末端。2.T4连接酶：T4噬菌体，既可以“缝合”双链DNA片段互补的粘性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。175根据酶的来源不同，分为两类：68方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接1.粘性末端连接176方式：(1)同一限制酶切位点连接1.粘性末端连接69BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接177BamHⅠ切割反应GGATCCT4DNA连接酶GATC不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。178不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg2.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端1792.平端连接72目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连180目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶重组体3.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。1813.同聚物加尾连接745´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´

3´3´5´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体1825´3´载体DNA5´3´目的基因限制酶或机械剪切限制酶4.人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

1834.人工接头(linker)连接76人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ184人工接头及其应用CCGAATTCG5´-EcoRⅠEco受体菌条件安全宿主菌：防止感染限制酶和重组酶缺陷：避免修饰、降解和重组整合处于感受态(competent)

（四）重组DNA导入受体菌185受体菌条件（四）重组DNA导入受体菌78大肠杆菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞宿主菌或受体细胞感受态细胞（competentcell）186大肠杆菌宿主菌或受体细胞感受态细胞（competentc导入方式转化(transformation)：大肠杆菌转染(transfection