电镜样品的基本制备技术之负染色技术

关于电镜样品的基本制备技术之负染色技术第1页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

负染色又称阴性反差染色，它是利用高密度的、且在透射电镜下又显示结构的重金属盐（如磷钨酸、醋酸铀等），把生物标本包围起来、在黑暗的背景上显示出呈现阴性反差样品的微细结构。所以负染色所显示的电镜图像，正好与超薄切片正染色相反，其样品结构为透明浅色，而背底则为无结构的灰色或黑色。对于负染色的机制，目前还不够清楚。第2页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

负染色技术首先，由Ha11（1955）、Hux1ey（1957）等人所采用，在后来的生物学研究中得到了越来越广泛的应用。负染色样品不需经过固定、脱水、包埋和超薄切片等复杂操作，而是直接对沉降的样品匀浆悬浮液进行染色。与超薄切片技术相比，该技术具有操作简便、用药量极少、省时快速及分辨力高等优点，现广泛用于细菌、病毒、大分子结构、亚细胞碎片及分离的细胞器等研究工作。第3页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

特别是在病毒学领域，负染色更能发挥其独到作用，是一项很重要的实验技术。第4页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

—、负染样品的制备负染色所用的样品，全部取自悬浮液。在这种悬浮液中样品必须达到一定的浓度和纯度，这样才能与染色剂之间产生特异和清晰的结合反应。操作时，将带有样品的悬液，滴于带有支持膜的铜网上，染色处理后即可进行电镜观察。其全部制备过程分述于下。第5页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

（—）浓缩取样法

适用于病毒等微细颗粒的浓缩处理。１．红细胞吸附法主要用于粘液病毒和副粘液病毒的制备。其操作方法为：将病毒悬液与等量红细胞混合，放置5分钟，使病毒吸附于红细胞表面；第6页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

而后，以800转／分速度低速离心15分钟，使吸附有大量病毒的红细胞沉于管底；最后，弃去上清液，加入少量生理盐水，于室温下或冰箱中存放3～4小时，病毒即可从红细胞表面释放到上面的溶液里，取溶液滴在铜网载膜上，进行后染色处理。第7页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

2．低渗释放法从培养瓶中刮下所培养的腺病毒或疱疹病毒，低速离心，弁上清液，于沉淀物中加入培养液与蒸馏水的混合液（比例为1：4），使细胞因低渗破裂而释放出病毒，然后快速冻融数次，再将冻融后的悬液低速离心，取其上清液滴膜染色。第8页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

3．抗体病毒凝集沉淀法某些病毒如鼻病毒、风疹病毒、小儿腹泻轮状病毒及甲、乙型肝炎抗原等，可于相应的抗体形成病毒一抗体复合物，经离心沉淀而浓缩，而后取浓缩的沉淀物滴膜染色，可找到较多的病毒。目前这一技术已广泛用于病毒疾病的快速诊断。第9页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

（二）直接取样法对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、水痘及疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱疹中取样，再将吸管中的泡液滴在带有支持膜的铜网上，待稍干后立即染色观察。此法主要用于临床快速诊断．第10页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

对于生长在固体培养基上的微生物，可用白金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释成悬液，即可滴样，待稍干后染色观察。对于生长在琼脂板上的噬菌体斑，也可采用直接取样法。第11页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

（三）离心提纯法

用于细菌、病毒、噬菌体等微生物或细胞匀浆中线粒体、微管等细胞器的提纯。先用低速离心（3000转／分），弃去较大杂质和细胞碎片．再用适当孔径的滤膜过滤，其滤液再经低温超速离心，最后取沉淀物制成悬液滴样染色。第12页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

二、染液的配制

一般均由重金属盐配制。最常用的有磷钨酸（PTA）、磷钨酸钾（KPT）、磷钨酸钠（NaPT）、醋酸钠、甲酸钠和钼酸铵等。当使用磷钨酸或磷钨酸盐时，可用蒸馏水或磷酸缓冲液配制成0.5％～3％的溶液，染色前应用：第13页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

１N的氢氧化钠或氢氧化钾将pH值调到6.4－7.0。醋酸铀则用0.2～0.5％水液．pH为4.5～5.5，染液在用前新鲜配制，盐溶解需20～30分钟。钼酸铵配制成2～3％溶液，使用时用醋酸铵将pH调至7.0～7.4之间。第14页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

作为负染色剂的条件：（l）具有较高的电子密度和较强的电子散射能力；（2）耐受电子束的轰击、在电子束照射下不升华；（3）在电镜下不呈现染色剂本身的结构；（4）化学稳定性好，不析出沉淀，与样品不发生化学反应，易在不规则样品表面渗透。第15页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

三、负染色操作方法

（—）滴染法将制备好的悬浮液样品,用毛细吸管吸取，滴于带有支持膜的铜网上。根据悬液内样品的浓度,立即或放置数分钟后，用滤纸从液珠边缘吸去多余液体，即可滴上染液，染色时间1～2分钟．而后即可用滤纸吸去染液，待干燥后即可电镜观察。第16页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

注意事项：（l）操作时吸管不能离铜网太近，应让液滴离开吸管后自然滴下，否则液滴易将铜网吸起；（2）支持膜应完好无损，吸管不能太粗，液滴不能太大，否则都不能形成良好的液珠；（3）病毒在液滴的边缘分布较多，操作时不宜用滤纸吸干，而任其自然稍干后再加染液。第17页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

（二）漂浮法先将样品悬浮液滴在干燥的载玻片上，再把带有支持膜的铜网放在悬浮液的液珠上漂浮以沾取样品；然后，用滤纸吸干铜网上的多余悬液，再将铜网在染液滴珠上漂浮，时间１－2分钟，最后再用滤纸将染液吸干即可观察。第18页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

四、影响负染效果的有关因素

（—）掌握染色时机染色应在铜网上的悬液将要干燥而又没完全干燥时进行，如果铜网上的悬液残留较多或完全干燥后染色，则严重影响染色效果，便得不到理想的负染电镜图像。第19页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

（二）控制pH值悬浮液与染液的pH值对负染效果有着明显影响，一股应使悬液呈中性或略偏酸性为宜（pH6.7～7.2）。为了确保悬液有足够的缓冲条件，多采用2％醋酸铵、碳酸铵溶液或其他缓冲液作为悬浮样品的稀释液。特别是磷钨酸染液的pH对病毒染色的影响更为显著，较酸的染液对病毒负染可产生较好的效果，而染液越是偏碱，其染色效果越差。染液的酸碱度不仅可影响染液的扩散，而且也会影响到病毒的结构。第20页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

（三）样品的纯度和浓度样品的纯度和浓度对负染均有明显影响，如果负染样品含杂质太多（如大量的细胞碎片、培养基残渣及盐类结晶等），会对负染色效果产生干扰，因此，样品在负染前要适当纯化。此外，悬液中的样品浓度要适当，浓度太稀时，会造成电镜下找不到样品或寻找困难；样品太浓时，会造成样品堆积而影响观察。因此，要求滴样时应做各种稀释度的对比观察。第21页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

（四）样品的均匀分散性在进行负染时，经常发生颗粒悬浮样品的凝集现像。此时，染色剂与样品形成电子不能穿过的团块，致使无法看清样品的微细结构。造成上述现象的主要原因，是悬浮样品不易在铜网上展开而形成的一种团聚现象。第22页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

为了促进悬浮样品的均匀分散性，以提高负染色效果。现在多采用分散剂或湿润剂，这种物质可以促使颗粒性悬液在铜网上扩散。常用的有牛血清白蛋白（BSA）、杆菌肽、二甲基亚砜（DMSO）、甘油丙二醇、十八（碳）烷等。其中，牛血清白蛋白配成0.005～0.05％的浓度，以0.5ml的样品内加入3～4滴为宜，或直接用0.01％的BSA作为离心沉淀物的稀释液。第23页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

杆菌肽配成30～40μg／ml水溶液，用于稀释沉淀的颗粒标本，或按适当比例加入悬浮样品内。也可将样品悬液与PTA及杆菌肽溶液等量混合后滴样。1％二甲基亚砜溶液加入染液中，其有加强染液穿透力和扩散作用。第24页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

（五）负染样品的电镜观察条件

１．负染色生物样品作电镜观察时，应选用最小物镜光阑孔（20～30μm），以增大样品的反差。２．电镜的加速电压一般可提高一些，以增加电子的穿透能力和分辨力。但有时提高电镜的加速电压反而会降低图像的反差，使分辨力降低，因此应灵活掌握。第25页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

３．对负染样品应采取快速观察快速照像的方法进行，一般在3～4万倍的放大倍率下，即可获得反差良好、自然柔和、高分辨的电镜图像。电镜观察时要尽量避免长时间照射样品，以免引起样品的损坏。第26页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

第三节微波辐射快速制样技术

为了适应日益增多的临床电镜诊断工作的需要，近几年来国内研制出了不少快速制样新方法。其中特别是“微波辐射快速制样技术”的应用．可谓一顶具有突破性意义的刨新技术。第27页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

该技术是在生物样品的固定、脱水、浸透、包埋诸项操作过程中，均将样品和试剂放入微波炉内，进行一定“火力”和时间的微波辐射，从而加速了制样过程，使其由数日缩短为数小时之内完成。这一技术具有简便省时，图像清晰，反差好等特点，是一套方法恒定、制样周期短和值得推广应用的新技术。第28页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

在国外首先由Mayere（1970）应用微波辐射进行组织固定以来，至1989年才由Hottay等将微波辐射应用于制样的全过程，发表了有关应用微波辐射进行生物组织电镜快速制样的文章，引起了电镜界的极大关注，展示了微波在电镜制样方面的应用前景。在国内则于近年来才有人对微波辐射制样技术，进行探索和应用。第29页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

一、微波辐射制样枝术的原理微波（mlcrOwave，MW）是一种非电离辐射的电磁波，其波长在1mm至1m之间，常用频率为2450MHz。在微波能的照射下，各种极性分子如生物组织中的各种离子、蛋白质侧链和水分子等，极易受到非离子化放射的影响，可在微波场中作高频振动。第30页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

这样微波能便转变成分子的随机动能，并产生了瞬间热使组织得以均匀加热。上述这种高速的分子运动，又促进了组织内化学试剂的扩散，并增强了与组织的结合；而且，在高速分子运动和碰撞中，完成了化学反应和平衡。以上只是微波辐射制样技术的初步原理，相信随着该技术的应用和逐渐成熟，一定会对其作用机理会有更确切、完美的解释。第31页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

二、微波辐射快速制样技术的基本程序

采用国产蚬华牌家用微波炉，其功率为550W，该炉设有P1—P1０共10个火力段。（—）取材取新鲜材料，按超薄切片法将样品块修成lmm3。（二）固定将样品浸泡于25％戊二醛中，并放入微波炉，在P1火力段下辐射15秒钟作前固定；继用磷酸缓冲液清洗样品3次，每次8分钟；再用1％锇酸浸泡样品，并放入微波炉中，在P1火力段下15秒钟，作后回定。第32页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

（三）脱水将样品从微波炉中取出，在室温下静放60秒钟，经磷酸缓冲液清洗3次（每次3～5分钟），用50～100％系列丙酮逐级脱水，每级脱水均在Pl火力段下辐射1～2分钟。（四）浸透先将样品放入环氧丙烷中，在室温下浸泡10分钟，而后依次投入环氧丙烷与环氧树脂1：l和l：2混合液中，在P4火力段下2分钟；而后将样品浸泡于纯环氧树脂中，在P4火力段下3分钟。第33页，共38页，2022年，5月20日，12点13分，星期五

（五）包埋将样品放于