分子诊断学-第十一章 单基因遗传性疾病的分子诊断

1单基因遗传性疾病的分子诊断

分子诊断学∙第十一章2分子诊断

通过检测基因的结构异常或其表达异常，对人体的健康状态和疾病做出诊断的方法。3基因结构异常基因表达异常DNAmRNA蛋白质核酸杂交PCR测序RT-PCR荧光PCRNorthernBlot基因芯片基因芯片WesternBlot组化ELISA蛋白芯片4（1）DNA分子杂交技术（2）PCR技术为基础的DNA诊断，特别是定量PCR和实时PCR的应用（3）生物芯片（biochip）技术为代表的高通量密集型检测技术发展阶段5发展趋势（1）DNAmRNA、protein（2）单一联合（3）定性定量（4）单基因多基因（5）诊断预防6遗传性疾病单基因遗传病（single-genedisorders）多基因遗传病（polygenicdisorders）单基因病常染色体遗传（autosomalinheritance）X连锁遗传（X-linkedinheritance）线粒体遗传(mitochondrialinheritance)

单基因病：指一种遗传病的发生只受一对等位基因的控制，其遗传方式遵循孟德尔分离定律。7基因突变点突变密码子插入或缺失移码突变缺失或重复基因倒位基因融合动态突变8分子诊断技术：点杂交限制性内切酶酶谱寡核苷酸探针PCR基因芯片DNA测序9基因诊断的策略从基因产物入手从基因定位入手从比较正常和异常基因的差异入手10诊断的时机症状前诊断产前诊断着床前诊断11DNA诊断RNA诊断FISH诊断fluorescenceinsituhybridization(FISH)12第一节血红蛋白病13血红蛋白的构成正常成年人血红蛋白A-HbA（a2b2）14（一）α珠蛋白基因

15（二）β珠蛋白基因

16血红蛋白病

血红蛋白病是由于珠蛋白基因异常导致珠蛋白肽链结构异常或合成异常所引起的遗传性血液病。17结构异常：

异常血红蛋白（镰状细胞贫血）合成异常：

a-地中海贫血

b-地中海贫血18

镰状细胞贫血由β链基因点突变引起，该病的主要原因是因为珠蛋白的β基因发生单一碱基突变，正常β基因的第6位密码子为GAG，编码谷氨酸，突变后为GTG，编码缬氨酸，成为HbS。19HbS四聚体在脱氧时，聚集成阵列，几乎变为结晶体，使红细胞发生镰变（sickling），弹性几乎丧失，无法通过直径比红细胞小的毛细血管。20（二）镰状细胞贫血的分子诊断方法限制性内切酶MstⅡ识别序列为CCTNAGG，N可以是任意核苷酸。因此β珠蛋白基因的第5、6密码子和第7密码子的第一个核苷酸序列是该内切酶的识别位点。但是在发生镰状突变后该酶切位点消失。

21MstIICCTGAGGCCTG

TGG突变型野生型1.15kb0.2kb1.35kb221.35kb1.15kbβΑ/βΑβΑ/βSβS/βS

限制酶切片段电泳后，经SouthernBlot检测23已知突变Gene部位和性质，合成寡和苷酸探针，32P标记，进行SouthernBlot杂交/斑点杂交。NormalβΑGeneProbeMutationβSGeneProbeASO探针诊断24正常探针突变探针βΑ/βΑβΑ/βSβS/βS斑点杂交结果25地中海贫血的分子诊断

地中海贫血（thalassemia）是由于珠蛋白链的合成不平衡所造成的一类常见的单基因遗传性、溶血性疾病。26α地中海贫血ζψζψα2ψα1α2α1θ1表型基因型正常人αα/αα静止型α地中海贫血α－/αα轻型α地中海贫血－－/ααHbH病α－/－－HbBart综合征－－/－－α地中海贫血是由于α珠蛋白基因缺失，或非缺失突变导致α珠蛋白链功能异常，或合成减少而引起的一种遗传性溶血性疾病。27由于以下基因突变导致α地中海贫血①点突变②移码突变③无义突变④mRNA加尾信号突变⑤终止密码子突变28α地贫的Gene诊断α基因不同程度的缺失引起不同类型的α地贫，α基因缺失1～4个。正常Gene组用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一个αGene时可得到10kb片段。BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobe2914kb10kbaa/aaaa/a-aa/--a-/----/--

正常缺1缺2缺3缺430分子诊断方法

（1）PCR法

31（2）Southern印迹法

α地中海贫血的基因簇限制性酶切片段长度多态性32β地中海贫血β地中海贫血是由于β珠蛋白基因功能下降或缺失所致的一类遗传性溶血性疾病。33β地中海贫血

1.遗传特征：突变是β地中海贫血的主要发病原因。（1）重型β珠蛋白生成障碍性贫血（thalassemiamajor），又称为β0珠蛋白生成障碍性贫血，其基因型为纯合子（β地/β地），即两个β基因都发生突变，使他们都不能合成正常的β珠蛋白，则没有血红蛋白A的合成，患者几乎靠输血维持生命。（2）β珠蛋白生成障碍性贫血，又称为β+珠蛋白生成障碍性贫血，其基因型为杂合子（β地/β），其中一个基因正常。34

在b珠蛋白基因第2内含子第654位核苷酸C→T突变（IVS-II-654C→T，简称b654），是中国人所特有的，而且是最常见的b地贫基因突变之一，占中国人b地贫总数的17%。35PCR和点突变基因检测技术成为β地中海贫血基因诊断的主要手段。目前常用的检测方法有：PCR-RDB法PCR-ASO法：优点是灵敏、准确，缺点是一次杂交只能检测一种突变。等位基因特异性PCR芯片技术分子诊断方法36b654mRNA的剪接模式ABCb-globingenemRNA(N)mRNA(M)IVSIIVSII654*579↓73bpIVSIIVSII37NormalPatient254bp181bpRT-PCR38第二节肌营养不良症

肌营养不良症(pseudohypertrophicmusculardystrophy)又称为假性肥大性肌营养不良，是一种常见的X连锁性隐性遗传病。其发生的原因是抗肌萎缩蛋白(Dystrophin)的缺乏。杜氏肌营养不良症(DMD)贝氏肌营养不良症(BMD)3940DMD/BMD患儿的临床表现后期双侧腓肠肌假性肥大，肌组织被结缔组织替代，并有脂肪浸润。典型表现为运动发育迟缓甚至倒退、鸭行步态、Gower氏体征。血清CK活性升高，心肌细胞损伤，心电图异常。DMD发病至10年左右常常卧床不起，多于20岁左右因心、肺功能衰竭等严重并发症而死亡。BMD发病较晚，症状较轻，进展缓慢，结局也比前者要好。41一、抗肌萎缩蛋白基因结构DMD基因定位于Xp21.2区域，是目前已知人类最大的基因，它包括79个外显子，约2.3×106bp，占X染色体的1.5%。基因缺失是DMD发生的主要原因（约占60%~70%），基因重复约占5%~10%、点突变约占20%、微小缺失和插入约占8%。DMD基因缺失集中在两个热点区域：一个在该基因的5′端；另一个在中央区。前者累及外显子1~11，约占总缺失的22%~27%，后者累及外显子44~53，约占总缺失的54%~60%。42二、DMD/BMD的分子诊断

1.多重PCR技术2.短串联重复序列（shorttandemrepeat,STR）连锁分析3.定量PCR(quantitativePCR)技术4.反转录PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)技术43

血友病是一种遗传性出血性疾病。发病原因是由于患者的血液中先天缺乏某种因子，根据缺乏因子的不同分为三种类型：血友病甲（缺乏凝血因子VⅢ，又称血友病A）、血友病乙（缺乏凝血因子Ⅸ，又称血友病B）和血友病丙（缺乏凝血因子Ⅺ）。血友病甲和血友病乙均属X性联隐性遗传，一般由女性传递，男性发病。血友病丙较少见，为常染色体不完全隐性遗传，男女均可发病。通常所说的血友病是指血友病甲。第三节血友病44一、甲型血友病及其分子诊断

（一）FⅧ的基因结构及发生机理

45（二）甲型血友病的分子诊断

1．基因倒位的检测2．非基因倒位的检测（1）PCR-RFLP法（2）PCR-SSCP法（3）可变数目的串联重复序列（variablenumberoftandemrepeat，VNTR）分析46二、乙型血友病及其分子诊断

（一）FⅨ的基因结构及其发病机理FⅨ基因位于Xq26.3~27.2，全长33.5kb，由8个外显子和7个内含子以及侧翼顺序中调控区域构成。FⅨ基因突变的种类十分繁多，几乎每一个乙型血友病家族均可能有各自的突变类型。到目前为止已经发现的突变类型有690多种，突变涉及整个基因的每个位置，包括基因点突变、缺失和插入突变。其中点突变约占80%，而大片段的缺失和基因重排较为少见。47（二）乙型血友病的分子诊断

由于FⅨ基因的缺陷具有明显的异质性，几乎每一个家系都有其特异基因突变类型，因此基因诊断除了大片段可用Southern印迹杂交外，一般多在具有多态性位点的DNA顺序两侧设计引物，经PCR扩增后进行RFLP连锁分析，常用的多态性限制酶标记位点有TaqⅠ、EcoRⅠ、XmnⅠ等位点，使用该方法可以对80%的乙型血友病作出诊断。48第四节其他遗传性疾病

一、苯丙酮酸尿症及其分子诊断

（一）PAH的基因结构PAH的基因定位于12q24.1，全长为90kbp，包括13个外显子和12个内含子，cDNA长为2488bp，编码451个氨基酸。

（二）苯丙酮酸尿症的分子诊断

1．PCR-STR法

2．PCR-SSCP法

3．PCR-RFLP法

4．多重ASPCR法

49二、Wilson’s病及其分子诊断

（一）Wilson’s病的基因结构

WD基因位于13q14.3，它编码一种Ｐ型铜转运ATP酶(ATP7B)，故又称ATP7B基因，全长约80kb，包括21个外显子和20个内含子，编码1411个氨基酸。

（二）Wilson’s病的基因诊断

现在常用的方法有：PCR-RFLP法、PCR-SSCP法、PCR-STR法、荧光PCR法等。

50三、G6PD缺乏症及其分子诊断

（一）G6PD的基因结构G6PD基因位于x染色体长臂末端（Xq28），基因全长20114bp，由13个外显子和12个内含子组成，编码的G6PD含515个氨基酸残基。最常见的基因突变型是1376G→T、1388G→A和95A→G。(二)G6PD缺乏症的基因诊断常利用扩增阻滞突变系统(amplificationrefractorymutationsystem,ARMS)法、PCR-RFLP法、PCR-ASO法、PCR-SSCP及DNA序列测定等方法。51四、Huntington病及其分子诊断

（一）Huntington病的基因结构及其发病机理Huntington病的基因位于4p16.3A。突变根源是染色体上有一段不稳定的(CAG)n三核苷酸的重复序列，CAG重复范围在正常的染色体为11～34个拷贝。而在Huntington病患者的染色体上，重复长度为36～121个拷贝，平均45个拷贝。（二）Huntington病的基因诊断Huntington病的99.0%

有CAG重复长度的扩增，通过PCR-ASO法检测Huntington病基因中的CAG重复的长度进行Huntington病的诊断。

52五、脆性X综合症及其分子诊断

脆性X智力低下基因位于Xq27.3，编码一个RNA结合蛋白。在第一个外显子内发现了一个CGG三核苷酸的重复序列，正常人该序列的拷贝数为6～50，脆性X综合症患