2023版高三一轮总复习生物（浙科版）选择性必修三生物技术与工程教案

第30讲发酵工程1.微生物的培养和分离b2.分离以尿素为氮源的微生物a一、微生物的培养需要适宜条件1．培养基为目标微生物提供适宜的生长环境(1)微生物和无菌技术①微生物：是指人们对所有形体微小、肉眼不可见的生物的统称。②无菌技术：指在培养某种微生物时，防止其他微生物混入，保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术。(2)培养基：是指人们为满足微生物生长繁殖或积累代谢产物的需求而配制的混合养料。(3)培养基的成分①水②无机盐a．影响微生物细胞的吸水能力。b．影响微生物的代谢及生长。③碳源：为微生物生长提供碳元素的物质。④氮源：为微生物生长提供氮元素的物质。⑤生长因子：有些微生物对培养基成分有特殊的需求，需要在培养基中有针对性地添加某些特定的维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶等有机化合物才能生长，这些化合物统称为生长因子。⑥微生物生活所需要的能量来源a．异养型微生物：培养基中的有机物。b．自养型微生物：光能或化学反应释放的能量。(4)培养基的理化特性影响微生物的生长。①“细菌喜荤，霉菌喜素”a．细菌培养基中要含有较高的有机氮，因此常用蛋白胨和酵母提取物等来配制。b．霉菌培养基一般用可溶性淀粉加无机物配制，或用添加蔗糖的豆芽汁等配制。②制备培养基时要注意调节培养基的pHa．细菌通常要求在中性偏碱的环境中生长。b．霉菌要求在中性偏酸的环境中生长。(5)根据培养基的物理特征可以把培养基分成液体培养基和固体培养基等。①液体培养基：是没有添加凝固剂的培养基，常用于大规模快速繁殖某种微生物。②固体培养基：通常是在液体培养基中添加一定量的凝固剂制成的。a．“平板”：将灭菌后未凝固的固体培养基注入培养皿中，冷凝后制成的固体培养基简称为“平板”。常用于微生物的分离、鉴定、活菌计数等。b．“斜面”：将灭菌后未凝固的固体培养基注入试管，将试管斜放在台面上，培养基冷却后在试管中形成了一个斜面，这样的固体培养基简称为“斜面”，常用于菌种保存。(6)根据培养基的化学成分可以把培养基分成合成培养基和天然培养基等。2．灭菌和无菌操作技术可以排除非目标微生物的干扰(1)保证器具与培养基无菌是获得微生物“纯”培养物的基础。①芽孢对于加热、紫外线照射和化学药物都具有极强的抵抗能力。②消灭器具和培养基中可能存留的各种类型微生物的方式：高压灭菌。(2)使用高压灭菌锅灭菌时所需的温度、压力和时间是根据要消灭的微生物芽孢等结构的耐热性来确定的。(3)灭菌后，要将高压灭菌锅中的实验用具及培养基及时取出。(4)接种过程中，防止其他微生物进入培养基是获得纯培养物的关键环节。①接种：将目标微生物转移到培养基中的过程称为接种。②接种工具：涂布器、接种环等。③瓶口或试管口：在接种过程中，打开塞子后和塞上塞子前都要将瓶口或试管口在酒精灯火焰上灼烧灭菌。④接种时要靠近酒精灯的火焰，利用燃烧产生的上升气流减少空气中微生物落入培养基的可能性。二、纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得1．采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的分离和纯化(1)接种：是指微生物进入培养基的过程。(2)单菌落：在固体培养基上采用划线或稀释涂布的方法接种，通过培养能获得由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团，这样的细胞集团称为单菌落。(3)平板划线法①连续平行划线是从培养基上的一点出发，向左右连续划平行线至覆盖整个培养基表面。(如图A)②扇形划线是从培养基上的一点出发，向多方向多次划线，每划一条线都要将接种环在酒精灯的火焰上灭菌，然后再次从同一起点变换方向划线。(如图B)A．连续平行划线B．扇形划线③多次连续平行划线接种时，划线可分3～4次进行。将培养皿旋转一定角度后，不需再次蘸取菌种，只需在上一次划线的末端区域直接开始划线即可。(如图C)(1)(2)(3)(4)C．多次连续平行划线(4)稀释涂布平板法：指接种时，通常需要先将菌液进行梯度稀释，并在培养皿侧面或底面做好标记后，将稀释度不同的菌液各取0.1_mL，加在固体培养基表面，然后用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面上进行培养。2．稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量(1)稀释涂布平板法方法：一是在保证能准确计数的前提下减小稀释度；二是将相同稀释度下的多组数值取平均值后再进行计算。即：每毫升菌液中微生物细胞的数量＝某一稀释倍数下至少3个培养皿的平均菌落数÷菌液稀释液体积×稀释倍数。(2)显微镜计数法步骤：先将专用的盖玻片盖在计数板上，再用吸管在中央平台盖玻片边缘滴加摇匀的酵母菌悬液，让菌液渗入盖玻片下直至充满计数区。3．调整培养基的配方和培养方式可有目的地培养某种微生物(1)不同自然环境中生活着的微生物代谢类型不尽相同。(2)许多微生物的代谢方式并不唯一。(3)培养基中营养物质的浓度及比例都会影响微生物的生长。(4)选择培养基①概念：在培养基中添加(或减去)某种化学成分，使得只有某些特定的微生物能够生长，其他微生物均不能生长，这样的培养基称为选择培养基。②用途a．从混杂的微生物群体中快速筛选出所需种类的目标微生物。b．从已知种类的混杂的细胞群体中筛选出特定的细胞。三、发酵工程为人类提供多样的生物产品1．某些食品、饮料及调味品是运用传统发酵技术生产的(1)最早制成的发酵饮料大概要算在游牧社会出现的奶酒。我国是酱油生产最早的国家。①许多传统发酵食品使用的菌种中都包含酵母菌和乳酸菌。②酵母菌或乳酸菌只是习惯上的归类，并不完全代表当今微生物分类学上的名称。a．酵母菌只是对进行出芽生殖或裂殖的真核、单细胞微生物的统称，已知的酵母菌至少有56属，约500多种。b．乳酸菌则是对能够发酵糖类产生乳酸的一类革兰氏阳性细菌的统称，已知的乳酸菌约有430多种。(2)发酵食品的不同风味由多种因素造成①不同的微生物、不同的菌株能够分泌的酶种类不同，分解大分子有机物后形成的产物也就不同。②菌株遗传上的差异会造成发酵产品的风味不同。③混菌发酵也影响发酵食品的风味。2．体验传统发酵(1)利用酵母菌、醋酸菌制作果酒和果醋①实验原理酵母菌在无氧条件下，通过厌氧呼吸，将葡萄糖氧化为乙醇和二氧化碳。有时放置过久的葡萄也会发出酸味或其他味道，这是其他微生物活动的结果。例如，醋酸菌在有氧条件下可将乙醇氧化为醋酸。②方法步骤：制备发酵装置及处理材料→酒精发酵→醋酸发酵(2)利用乳酸菌发酵制作泡菜①实验原理泡菜是利用附生在蔬菜表面的植物乳杆菌、短乳杆菌和明串珠菌等发酵制成的。这些微生物一般为厌氧、兼性厌氧或微好氧菌。它们的发酵产物不仅有乳酸，还会有醇、酯等，因而使泡菜具有特殊的风味。②方法步骤：处理材料→腌制泡菜3．发酵工程利用现代工程技术及微生物的特定功能，工业化生产人类所需产品微生物工业发酵的基本过程(1)选育高产、优质的菌种是发酵工业的前提条件。(2)将菌种扩大培养才能满足大规模生产的需要。(3)对发酵过程进行控制才能获得所需要的产品。(4)控制发酵过程是保证发酵生产高效顺利进行的重要措施。(5)菌种在不同的发酵阶段要求的环境条件是不同的。(6)分离或提纯发酵产品是工业发酵制取产品必经的步骤。(7)分离后的生物产品还需要进一步提纯，经过质检合格后才能成为产品。4．发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要的应用价值(1)发酵工程特点：生产条件温和、原料丰富且价格低廉、废弃物对环境影响小且容易处理。(2)微生物发酵的食品和饮料在生活中比比皆是，高居微生物工业的榜首。(3)绝大多数抗生素也是微生物发酵的产物，或由微生物发酵产物加工而成。(4)近年来，在医药领域开发的酶抑制剂、免疫调节剂、类激素、抗氧化剂、生物表面活性剂和抗辐射药物等许多新药也是微生物发酵的产物或衍生物。(5)酶制剂是发酵工程对工业化生产的又一贡献。考点1培养基与无菌技术培养基类型及作用划分标准培养基种类特点用途按物理特征划分液体培养基不加凝固剂工业生产半固体培养基加凝固剂，如琼脂观察微生物的运动固体培养基微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种等按化学成分划分天然培养基含化学成分不明确的天然物质工业生产合成培养基培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配制)纯化、鉴别按用途划分选择培养基允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长富集、分离出特定微生物，如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度食盐鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物，如用伊红美蓝培养基鉴别大肠杆菌(菌落呈黑色)2．灭菌、消毒与防腐处理方法结果应用实例灭菌强烈的物理、化学方法杀灭物体表面以及内部的一切微生物对器具和培养基进行高压灭菌消毒较温和的物理、化学方法仅杀死物体表面或内部一部分不需要的微生物消毒剂对皮肤、水果或饮用水进行消毒防腐根据微生物生长繁殖的特点，控制理化因素抑制微生物生长繁殖用除氧剂抑制需氧型微生物的繁殖，采用低温、盐腌、糖渍、干燥等防腐措施保存食物1．下列有关培养基配制的描述正确的是()A．液体培养基常用于菌种的分离、计数、鉴定B．任何培养基都必须含有碳源、氮源、水、无机盐等成分C．是依据人们的需求，配制出的供微生物生长繁殖的营养基质D．微生物的生长除受营养因素影响外，还受pH、渗透压等影响D[固体培养基常用于菌种的分离、计数、鉴定，A错误；培养基不一定含有碳源、氮源，如培养自养型微生物的培养基不需加碳源，分离自生固氮菌的培养基不需加氮源，B错误；人们为满足微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质叫培养基，C错误；微生物的生长除受营养因素影响外，还受pH、氧气、渗透压等的影响，D正确。]2．微生物的实验室培养获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌入侵，下列无菌操作中错误的是()A．对实验用的培养基，采用高压灭菌锅进行灭菌B．接种所使用的涂布器或接种环等工具均需灭菌后再使用C．对操作者的双手、衣着以及操作空间等，采用紫外线进行消毒D．对试管口、锥形瓶口等部位，通过火焰灼烧进行灭菌C[对实验用的培养基，采用高压灭菌锅进行灭菌，A正确；接种所使用的涂布器或接种环等工具均需灭菌后再使用，B正确；对操作者的双手采用酒精进行消毒，C错误；对试管口、锥形瓶口等部位，通过火焰灼烧进行灭菌，D正确。]考点2微生物的分离纯化方法与计数1．两种纯化方法的比较主要方法平板划线法稀释涂布平板法主要步骤接种环在固体培养基表面划线系列梯度稀释操作和涂布平板操作接种工具接种环涂布器菌体获取在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体能否用于计数不能计数可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板共同点都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征2．微生物的计数常用的微生物的计数方法有直接计数法和间接计数法。二者比较如下：内容直接计数法间接计数法主要用具显微镜、血细胞计数板涂布器计数依据细胞个数培养基上菌落数优点计数方便、操作简单计数的是活菌缺点不能区分死菌与活菌操作较复杂，且有一定误差计算公式每毫升菌液含细胞数＝400×10000×每小格平均细胞数×稀释倍数每毫升菌液中微生物细胞的数量＝某一稀释倍数下至少3个培养皿的平均菌落数÷菌液稀释液的体积(mL)×稀释倍数1．在分离、纯化酵母菌实验中，划线接种(甲)、培养结果(乙)如图所示，且甲、乙的对应位置不变，有关叙述错误的是()甲乙A．配制培养基时需进行高压灭菌B．甲中a区域为划线的起始位置C．连续划线的目的是获得单个细菌形成的单菌落D．图示接种过程中接种环灼烧了5次B[为了能彻底灭菌，配制的培养基需进行高压灭菌，A正确；起始划线的区域长出的菌落多且密，甲中d区域为划线的起始位置，a区域为划线的结束位置，B错误；连续划线的目的是获得单个细菌形成的单菌落，C正确；由于每次使用接种环前后都要灼烧灭菌，图示甲中共有4次划线接种，接种过程中接种环灼烧了5次，D正确。]2．(2021·四川绵阳期末)某同学将1mL土壤样液稀释100倍，在3个平板上用稀释涂布平板法分别接入0.1mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57和58，下列叙述错误的是()A．可得出土壤样液中活菌大约为5.7×107个/LB．此方法统计的菌落数往往比实际的活菌数目低C．一般选择菌落数为30～300的平板进行计数D．显微镜计数法统计的是稀释液中的活菌数D[将1mL样品稀释100倍，在3个平板上分别接入0.1mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57和58，据此可得出每升样品中的活菌数为(56＋57＋58)÷3÷0.1×1000×100＝5.7×107个/L，A正确；由于两个或多个细胞连在一起时，在平板上观察到的只是一个菌落，所以统计的菌落数往往比实际的活菌数目低，B正确；为保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数，C正确；显微镜计数法统计的是稀释液中所有菌体的数目，包括活菌和死菌，D错误。]考点3分离以尿素为氮源的微生物和培养基的选择作用1．能分解尿素的微生物的分离与鉴定原理(1)分离原理当培养基中只有尿素作为氮源时，只有能分泌脲酶的微生物才能在该培养基中生长。因为它们可以通过脲酶将尿素降解为氨，作为其生长的氮源。利用这种培养基就分离出土壤中能产生脲酶的微生物。(2)鉴定原理因为微生物分解尿素产生的氨会使培养基的碱性增强，若在培养基中加入在酸性情况下呈黄色、碱性情况下呈红色的酚红指示剂，就可根据菌落周围是否出现红色区域，进一步鉴定尿素分解菌。在相同培养条件下，圆形红色区域愈大，表明这种菌利用尿素的能力愈强。2．特定培养基的设计原理与应用实例特定培养基的设计原理应用实例具体处理分离菌种依据营养需求不添加碳源自养微生物(硝化细菌等)不添加氮源固氮微生物(圆褐固氮菌等)以尿素为唯一氮源能分解尿素的微生物以石油为唯一碳源能分解石油的微生物加入某种化学物质，其不作为营养物质，对目标微生物无害，但会抑制或杀死其他微生物加入青霉素、四环素或链霉素抑制细菌和放线菌生长→分离酵母菌、霉菌等加入10%的酚抑制细菌和霉菌生长→分离放线菌1．下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述错误的是()A．利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度B．若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置未接种的完全培养基作为对照C．该实验应采用稀释涂布平板法D．用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后不会使酚红指示剂变红B[利用稀释涂布平板法估算菌落数目的关键是有恰当的稀释度，若稀释倍数太低，菌落太多，会长在一起，稀释倍数太高，平板上菌落数目过少，都不宜进行计数，A正确；若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需设置接种在没有选择作用的完全培养基上培养作为对照，B错误；该实验应采用稀释涂布平板法，C正确；分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解产生氨，使培养基的碱性增强，用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌，则能维持pH稳定，不会使酚红指示剂变红，D正确。]2．自然界中的微生物往往是混杂生长的，人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定，下面是有关土壤中分解尿素的细菌分离和计数的实验过程，请回答有关问题。(1)若取土样6g，应加入________mL的无菌水配制成稀释10倍土壤溶液。因土壤中细菌密度很大，需要不断加以稀释，配制成101～107不同浓度的土壤溶液。将103～107倍的稀释液分别吸取0.2mL加入固体培养基上，用涂布器将菌液铺平，每个稀释度下至少涂布3个平板，这种接种方法称为________________。将接种的培养皿放置在37℃恒温培养箱中培养24～48h，观察并统计菌落数，结果如下表，其中________倍的稀释比较合适，由此计算出每克土壤中的菌落数为________个。这种方法测定的菌落数往往比活菌的实际数目________(填“低”或“高”)。稀释倍数103104105106107菌落数/个1号平板4783672772652号平板4963542612083号平板509332254293(2)若研究尿素分解菌的群体生长规律，可采用平板划线法分离土壤中的尿素分解菌。操作时，接种环通过灼烧灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是_________________________________________________________________________________________________。将分离纯化后的单个菌落进行液体培养，可采用定期取样的方法进行计数。若以一个大方格(体积为0.1mm3)有25个中方格的计数板为例进行计算，设5个中方格中总菌数为45，菌液稀释倍数为102，那么原菌液的菌群密度为________个/mL。[解析](1)根据题意分析，需要稀释10倍的土壤溶液，因此应该将6g土样加入54mL的无菌水进行配制；将103～107倍的稀释液分别吸取0.2mL加入固体培养基上，用稀释涂布平板法将菌液用涂布器涂布到固体培养基上；估算样品中的活菌数时，往往选取菌落数在30到300之间的平板，分析表格中数据可知，稀释倍数为105的平板菌落数在这一范围；每克土壤中的菌落数为(277＋261＋254)÷3×105÷0.2÷6＝2.2×107个。稀释涂布平板法进行微生物计数时，由于菌落之间会相互重叠，因此测定的菌落数往往比活菌的实际数目低。(2)用平板划线法分离土壤中的尿素分解菌时，为了将聚集的菌体逐步稀释以便获得(不连续)单个菌落，故在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。若以一个大方格(体积为0.1mm3)有25个中方格的计数板为例进行计算，设5个中方格中总菌数为45，菌液稀释倍数为102，那么原菌液的菌群密度＝45×5÷0.1÷10－3×102＝2.25×108个/mL。[答案](1)54稀释涂布平板法1052.2×107低(2)将聚集的菌体逐步稀释以便获得(不连续)单个菌落2.25×108考点4传统发酵与发酵工程1．利用酵母菌、醋酸菌制作果酒和果醋(1)发酵菌种的比较果酒制作果醋制作发酵菌种来源附着在葡萄皮上的酵母菌空气中的醋酸菌分类地位单细胞真核生物单细胞原核生物繁殖方式出芽生殖、孢子生殖二分裂生殖代谢类型异养兼性厌氧型异养需氧型联系醋酸发酵可以在酒精发酵的基础上进行，酒精发酵为醋酸发酵提供原料(2)发酵过程中酵母菌数量、酒精含量及pH变化分析①果酒发酵过程中酵母菌数量和酒精含量的变化a．菌体数量的变化：发酵初期，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖。发酵中期形成无氧环境，酵母菌数量增加缓慢，最后达到稳定。发酵后期由于酒精含量较高，可能会导致酵母菌大量死亡。b．酒精含量的变化：发酵初期，酵母菌进行有氧呼吸，酒精含量很低。发酵中期，酵母菌进行无氧呼吸产生大量酒精，酒精含量增加。发酵后期，由于酒精含量升高，大量酵母菌死亡，酒精含量不再增加。②果酒、果醋制作过程中pH的变化a．果酒发酵时产生的部分CO2会溶于发酵液，使发酵液pH下降，最后趋于稳定。b．果醋发酵时产生的醋酸溶于发酵液，使发酵液pH下降，最后趋于稳定。(3)注意事项①所放入的葡萄体积不要超过矿泉水瓶体积的1/2。为提高酒精产量，可在两个矿泉水瓶中适当添加白糖。②矿泉水瓶中不可加水；不可用不能自动排气的玻璃瓶作为发酵的容器，以免发酵产生的大量气体使瓶子炸裂，造成危险。2．利用乳酸菌发酵制作泡菜(1)与泡菜制作有关的菌类——乳酸菌生物学分类原核生物常见类型明串珠菌、植物乳杆菌、短乳杆菌分布广泛分布于空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道内代谢类型异养厌氧型生产应用制作酸菜、酸奶等发酵原理C6H12O6→2C3H6O3(2)制作泡菜的注意事项①营造无氧环境a．选择的泡菜坛要密封性好。b．加入蔬菜后要注入煮沸冷却的盐水，使盐水没过全部菜料。c．盖上坛盖后要在坛盖边沿的水槽中注满清水。②控制适宜的发酵温度温度过高易致杂菌滋生；温度过低不利于乳酸发酵，会使发酵时间延长。③控制发酵时间一般在腌制10天后，亚硝酸盐含量开始下降。但泡菜发酵时间并不是越长越好，一方面发酵时间过长，可能会产生其他有害物质，另一方面，发酵时间过长，乳酸含量过高，口味不佳。3．发酵工程中心环节的分析1．如图甲是果酒和果醋发酵的装置图，图乙是果酒和果醋制作过程中发生的物质变化，下列有关叙述中正确的是()甲乙A．甲装置可先用于果醋的制作，后用于果酒的制作B．用甲装置制作果酒时，要加入适量的酵母菌，且一直关紧阀bC．酵母菌是嗜温菌，所以果酒发酵所需的最适温度高于果醋发酵D．过程③和④都需要氧气的参与，但反应场所不同D[因为醋酸菌可利用酒精产生醋酸，但酵母菌不能利用醋酸产生酒精，故甲装置可先用于果酒的制作，后用于果醋的制作，A错误；甲装置中，阀b控制排气，阀a控制进气，制作果酒时应关闭阀a以创造缺氧环境，适时打开阀b以排出酵母菌进行无氧呼吸产生的CO2，B错误；醋酸菌是嗜温菌，果醋发酵所需的最适温度高于果酒发酵时的温度，C错误；过程③表示有氧呼吸的第二和第三阶段，故过程③需要氧气的参与，反应场所是线粒体；过程④表示果醋发酵，由于醋酸菌是好氧细菌，因此该过程需要氧气的参与，但醋酸菌是原核生物，没有线粒体，故③和④过程的反应场所不同，D正确。]2．下列关于生物技术在生活中应用的说法错误的是()A．利用发酵技术，在鲜奶中加入乳酸菌可制成酸奶B．制作泡菜的坛子加水密封是为了抑制乳酸菌繁殖C．制葡萄酒时，要将温度控制在18℃～25℃D．变酸果酒表面的菌膜是醋酸菌在液面大量繁殖形成的B[制酸奶要用到乳酸菌，乳酸菌发酵产生乳酸，使得酸奶有一种特殊的酸味，A正确；乳酸菌属于厌氧菌，制作泡菜的坛子加水密封，可创造无氧环境，利于乳酸菌的繁殖，B错误；20℃左右最适合酵母菌繁殖，酒精发酵时一般将温度控制在18℃～25℃，C正确；在变酸的果酒表面观察到的菌膜可能是醋酸菌在液面大量繁殖形成的，D正确。]3．下列关于发酵工程的说法错误的是()A．在菌种选育过程中，可以利用人工诱变或基因工程等手段B．虽然青霉素是抗生素，但在青霉素生产过程中仍然需要严格灭菌C．发酵时，发酵条件变化会影响微生物生长，不影响微生物的代谢途径D．发酵工程的产品可以采用过滤、沉淀、蒸馏、萃取等方法提取C[环境不同，同种微生物的代谢产物可能不同。发酵时，pH、氧气、温度等发酵条件变化不仅会影响微生物生长，也会影响微生物的发酵产物，C错误。]1．(2021·浙江1月选考)用白萝卜制作泡菜的过程中，采用适当方法可缩短腌制时间，下列方法中错误的是()A．将白萝卜切成小块B．向容器中通入无菌空气C．添加已经腌制过的泡菜汁D．用沸水短时处理白萝卜块B[将白萝卜切成小块可以扩大白萝卜与腌料的接触面积，缩短腌制时间，A正确；泡菜制作所需菌种为乳酸菌，制作过程中应保持无氧环境，向容器中通入无菌空气不利于腌制，B错误；泡菜汁中含有一定量的发酵菌种，所以在腌制过程中，加入一些已经腌制过的泡菜汁可缩短腌制时间，C正确；用沸水短时处理，可抑制某些微生物的繁殖，提高泡菜品质，也可缩短腌制时间，D正确。]2．(2021·浙江6月选考)下列关于原生质体和细胞计数的叙述错误的是()A．测定植物原生质体的密度时，可用血细胞计数板B．红墨水不能进入活细胞，可用于检测细胞的存活状态并计数C．稀释涂布平板法和划线分离法均能得到单菌落，都可用于细胞计数D．酵母菌在液体培养基中培养一段时间后，可用比浊计测定其密度C[可用血细胞计数板对原生质体进行计数，一般计数总数不少于300个细胞，A正确；活细胞的细胞膜具有选择透过性，红墨水中的色素分子不能透过细胞膜，当细胞死亡后，细胞膜失去选择透过性，红墨水中的色素分子能进入细胞，所以可用红墨水检测细胞的存活状态并计数，B正确；划线分离法不能用于细胞计数，C错误；酵母细胞的密度与浑浊度指标存在一定的数量关系，所以酵母菌在液体培养基中培养一段时间后，可用比浊计测定其密度，D正确。]3．(2021·浙江6月选考)回答与甘蔗醋制作有关的问题。(1)为了获得酿造甘蔗醋的高产菌株，以自然发酵的甘蔗渣为材料进行筛选。首先配制醋酸菌选择培养基：将适量的葡萄糖、KH2PO4、MgSO4溶解并定容，调节pH，再高压灭菌，经________后加入3%体积的无水乙醇。然后将10g自然发酵的甘蔗渣加入选择培养基，震荡培养24h。用________将少量上述培养液涂布到含CaCO3的分离培养基上，在30℃培养48h。再挑取分离培养基上具有________的单菌落若干，分别接种到与分离培养基成分相同的________培养基上培养24h后，置于4℃冰箱中保存。(2)优良产酸菌种筛选。将冰箱保存的菌种分别接入选择培养基，培养一段时间后，取合适接种量的菌液在30℃、150r/min条件下震荡培养。持续培养至培养液中醋酸浓度不再上升，或者培养液中________含量达到最低时，发酵结束。筛选得到的优良菌种除了产酸量高外，还应有________________(答出2点即可)等特点。(3)制醋过程中，可将甘蔗渣制作成固定化介质，经____________后用于发酵。其固定化方法为________。[解析](1)高压灭菌刚结束时，培养基温度较高，要等培养基冷却后再加入3%体积的无水乙醇。涂布分离法可用于单菌落分离，使用玻璃刮刀将待分离的菌液涂布到分离培养基的整个平面上。醋酸菌发酵产生的醋酸会使培养基中的CaCO3分解，形成透明圈。菌落小，透明圈大，代表着高产醋酸菌。菌种的贮存方法：在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面培养基上，培养24h后，置于4℃冰箱中保存。(2)醋酸发酵结束的标志性：产物不再增加(醋酸浓度不再上升)或原料消耗到最低值(乙醇含量达到最低)。优质菌种不光要产酸高，还要耐高酸，同时还要耐酒精(原料)等特点。(3)我们在利用微生物时，常常要求所利用的微生物不被其他微生物污染。因此，在培养微生物时必须进行无菌操作，所以作为固定化介质的甘蔗渣需要经过灭菌处理。甘蔗渣类似果醋发酵装置中的锯末，可使醋杆菌吸附在甘蔗渣上进行发酵。[答案](1)冷却玻璃刮刀较大透明圈斜面(2)乙醇耐酒精度高、耐酸高(3)灭菌吸附法4．(2021·广东卷)中国科学家运用合成生物学方法构建了一株嗜盐单胞菌H，以糖蜜(甘蔗榨糖后的废弃液，含较多蔗糖)为原料，在实验室发酵生产PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整体利用价值。工艺流程如图。回答下列问题。(1)为提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液体培养基中将蔗糖作为__________，并不断提高其浓度，经多次传代培养(指培养一段时间后，将部分培养物转入新配的培养基中继续培养)以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用______________的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。此外，选育优良菌株的方法还有____________________等(答出两种方法即可)。(2)基于菌株H嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，研究人员设计了一种不需要灭菌的发酵系统，其培养基盐浓度设为60g/L，pH为10，菌株H可正常持续发酵60d以上。该系统不需要灭菌的原因是________________________________________________________________________________(答出两点即可)。(3)研究人员在工厂进行扩大培养，在适宜的营养物浓度、温度、pH条件下发酵，结果发现发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中__________可能是高密度培养的限制因素。(4)菌株H还能通过分解餐厨垃圾(主要含蛋白质、淀粉、油脂等)来生产PHA，说明其能分泌__________________。[解析](1)为提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，可将蔗糖作为碳源。培养过程中可定期取样并采用稀释涂布平板法(显微镜计数法)进行菌落计数，评估菌株增殖状况。除了上述方法选育能耐受高浓度蔗糖的菌株H外，还可通过诱变育种、基因工程育种来选育优良菌株。(2)由题意可知，菌株H具有嗜盐、酸碱耐受能力强的特性，在该系统中，其他杂菌会因盐浓度过高或pH不适宜而死亡，故不用灭菌。(3)由于产物中产生了少量乙醇，说明发酵液缺氧导致菌株H进行了无氧呼吸，最终菌株H由于能量供应不足而使得其细胞增殖和PHA的产量均未达到预期，所以发酵条件中氧气可能是高密度培养的限制因素。(4)餐厨垃圾主要含有蛋白质、淀粉、油脂等，菌株H能利用餐厨垃圾来生产PHA，说明其能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶，还有与PHA合成相关的酶。[答案](1)碳源稀释涂布平板法(显微镜计数法)诱变育种、基因工程育种(2)培养基是高盐浓度的液体环境，杂菌会由于渗透失水而死亡；培养基的液体环境是碱性的，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制(3)氧气(4)蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和PHA合成相关的酶

第31讲植物细胞工程植物的克隆b一、通过植物组织培养可获得完整植株1．植物细胞的全能性使离体组织发育成完整植株成为可能(1)植物组织培养：指在无菌和人工控制条件下，将离体的植物体器官、组织或细胞等培养在人工配制的培养基上，使其生成完整植株或使其细胞增殖并产生细胞代谢产物的技术。(2)外植体：用于培养的植物的离体器官、组织等称为外植体。(3)植物细胞的全能性：指已分化的细胞中遗传物质一般不发生改变，植物体的每个生活细胞都具有该植物所包含的全部的遗传信息，因而具有发育成完整植株的潜能。(4)植物组织培养的理论基础：外植体因脱离了母体的影响，一定条件下能实现其全能性。(5)离体培养条件下，植物细胞全能性的表达是通过细胞的脱分化和再分化实现的。①脱分化：指离体条件下已分化的细胞经过诱导，失去特有的结构和功能，重新获得分裂能力。②愈伤组织：指脱分化的细胞不断分裂增殖，产生无组织结构、松散的薄壁细胞团。③再分化：指愈伤组织细胞在一定条件下，可重新分化为各种类型的细胞，进而形成芽或根等，再生出新的植株的过程。(6)愈伤组织再分化为完整植株的途径：①器官发生途径；②体细胞胚发生途径。2．离体植物器官、组织和细胞在适宜条件下方可发育成完整的植株(1)植物组织培养是在严格的无菌条件下进行的。(2)培养基能为离体植物材料提供适宜的营养条件。(3)植物组织培养的培养基中通常含有水、无机盐、有机营养成分、琼脂、植物激素等物质。①无机盐为植物提供必需的矿质元素。②有机营养成分中含有糖类、氨基酸、维生素等物质。a．糖类既可作为碳源和能源物质，又参与维持培养基的渗透压。b．维生素往往以辅酶的形式参与细胞的蛋白质、脂质、糖代谢等重要活动。③植物激素调控细胞的脱分化和再分化过程。a．植物生长调节物质包括天然植物激素和人工合成的激素类似物。b．植物生长素类和细胞分裂素类物质是植物组织培养不可缺少的两类调节物质，两者的浓度和配比在脱分化和再分化中起着关键作用。c．生长素类和细胞分裂素类物质的比值大时，有利于根的形成；比值小时，则促进芽的形成。3．植物组织培养通过多种途径有效地提高生产效率(1)组织培养技术可快速繁殖植物①根据培养过程，植物组织培养可分为初代培养和继代培养。a．初代培养：指从植物体上分离下来的外植体的第一次培养。b．继代培养：将初代培养获得的培养物转移到新的培养基上继续进行扩大培养。②离体繁殖主要以营养器官为外植体，再生个体的遗传性与母体一致，因此快速繁殖的过程就是植物克隆的过程。组织培养再生的个体被称为克隆植物，可以很好地保持品种的优良性状。(2)组织培养技术可用于植物脱毒①选材部位：植物生长点附近(茎尖、芽尖等)。②操作过程：利用组织培养方法，取一定大小的茎尖进行培养，再生的植株有可能不带病毒，从而获得脱病毒苗，再用脱病毒苗进行繁殖。③优点：种植的作物不会或极少发生病毒。(3)组织培养技术可用于生产人工种子①人工种子：是将植物离体培养产生的体细胞胚、芽、愈伤组织等包埋在含有营养成分和保护功能的物质中而制成的。在条件适宜时，它同普通种子一样可以发芽成苗。②人工种子通常包括体细胞胚、人工胚乳和人工种皮三部分。③优点：a．生产过程不受季节限制；b．可以大量、快速繁殖优良品种。(4)组织培养技术可用于细胞代谢产物的工业化生产(5)组织培养技术可用于作物新品种的培育①细胞突变体的筛选a．产生原因：在组织培养过程中，培养物的细胞处于不断分裂状态，易受培养条件和外界压力(如射线和化学物质等)的影响而发生变异。b．优点：在细胞和原生质体培养时进行人工诱变，诱变频率大于个体或器官水平，而且在较小的空间内一次可处理大量材料。②单倍体育种a．过程：花药离体培养→单倍体植株eq\o(→,\s\up8(染色体加倍),\s\do6())纯合子植株。b．优点：后代是纯合子，能稳定遗传；明显缩短了育种的周期。③离体的器官、组织、细胞、原生质体常作为外源基因的受体。4．活动：菊花的组织培养及幼苗的移栽(1)实验原理通过调节激素的比例可控制菊花外植体的生长发育。(2)方法步骤菊花外植体的接种与培养→菊花试管苗的生根培养→菊花试管苗的移栽。二、通过体细胞杂交可获得新的植物1．成功培养原生质体是植物体细胞杂交技术的基础(1)植物体细胞杂交：将两个来自不同种植物的体细胞融合成一个杂种细胞，并将杂种细胞培育成新的植物体的技术。(2)获得原生质体的具体方法是：在0.5～0.6mol/L的甘露醇(或一定浓度的蔗糖)溶液环境(较高渗透压)下，用纤维素酶和果胶酶混合液处理根尖、叶片、愈伤组织或悬浮培养细胞，消化除去细胞壁，获得球形的原生质体。2．由杂种细胞培育出的新植物体可能会具有新的特性(1)植物体细胞杂交过程①获得原生质体的方法：酶解法。②诱导原生质体融合的技术手段：电刺激、离心、振荡、聚乙二醇等。③形成杂种细胞：去除水解酶、培养融合的原生质体、再生出新的细胞壁。④获得完整植株：杂种细胞经过培养进一步分裂、分化，进而发育成完整的植株。(2)杂种植株的鉴定和选育原因①同一体系中再生的植株并非均为体细胞杂种植株。②即使得到了杂种细胞，培养过程中也可能出现染色体的丢失、结构异常等情况。(3)意义：克服远缘杂交的不亲和性，获得新品种。(4)应用：该技术已经广泛应用于多种植物的育种研究。(5)成果：获得了许多具有优良性状的新的植物种质资源。考点1植物组织培养与实践应用1．植物组织培养的原理——植物细胞的全能性(1)概念：具有某种植物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整植株的潜能。(2)原理：细胞内含有本物种的全套遗传信息。(3)全能性表达条件：具有完整的细胞结构，处于离体状态，提供一定的营养、激素和其他适宜外界条件等。(4)一般来说，细胞全能性大小与细胞分化程度呈反比。(5)全能性大小：①植物细胞：受精卵>生殖细胞>体细胞②动物细胞：受精卵>生殖细胞>体细胞核(动物细胞全能性受限制，但细胞核具有全能性)2．植物组织培养的过程(1)培养对象：离体的植物器官、组织或细胞。(2)培养条件：无菌、人工配制的培养基、相关激素等。(3)培养结果：产生愈伤组织、丛芽(或丛根、胚状体)，最终形成完整植株。(4)植物激素在植物组织培养中的作用生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素，其作用及特点为：①在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势。②使用顺序不同，结果不同，具体如表：使用顺序实验结果先使用生长素，后使用细胞分裂素有利于细胞分裂，但细胞不分化先使用细胞分裂素，后使用生长素细胞既分裂又分化同时使用分化频率提高③用量比例不同，结果也不同eq\f(生长素用量,细胞分裂素用量)的值eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(高：利于根的分化、抑制芽的形成,低：利于芽的分化、抑制根的形成,适中：促进愈伤组织的形成))3．植物组织培养技术的实践应用(1)植物繁殖的新途径①离体繁殖：优点是繁殖快，并可保持亲本的优良性状。②作物脱毒：利用茎尖组织培养技术获得脱毒苗。③人工种子：将植物离体培养产生的体细胞胚、芽、愈伤组织等包埋在含有营养成分和保护功能的物质中制成的种子。(2)作物新品种的培育：单倍体育种和突变体的利用。举例如下。优点：稳定遗传，缩短育种年限。1．有关植物组织培养，下列说法不正确的是()A．脱分化的过程应该用固体培养基，并对外植体进行消毒处理B．植物激素的浓度、使用的先后顺序和比例都会影响组织培养的结果C．该技术可以进行快速繁殖，并可以使作物不带病毒，获得脱毒苗D．培养到愈伤组织阶段经过人工薄膜包装并加入营养物质等可得到人工种子D[脱分化的过程应该用固体培养基，对外植体要进行严格的消毒处理，A正确；植物激素的浓度、使用的先后顺序及用量的比例，都会影响脱分化和再分化，进而影响组织培养的结果，B正确；植物组织培养技术可以高效快速地实现种苗的大量繁殖，还能获得脱毒苗，C正确；人工种子是将植物离体培养产生的体细胞胚、芽、愈伤组织等包埋在含有营养成分和保护功能的物质中而制成的种子，D错误。]2．下列关于植物细胞工程实际应用的叙述不正确的是()A．离体繁殖技术的原理是植物细胞的全能性B．利用茎尖组织培育的幼苗不一定全是脱毒幼苗C．利用人工种子繁殖优良品种不会出现性状分离D．未脱毒马铃薯的产量与脱毒马铃薯的产量相同D[植物离体繁殖技术是指用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术，其原理是植物细胞的全能性，A正确；利用茎尖组织培育的幼苗不一定全是脱毒幼苗，也可能是减毒幼苗，B正确；人工种子是利用植物组织培养得到的，则利用该人工种子繁殖优良品种属于无性生殖，所以不会出现性状分离，C正确；一般来说，未脱毒马铃薯的产量比脱毒马铃薯的产量低，D错误。]3．培养胡萝卜根组织可获得试管苗，获得试管苗的过程如图所示。回答下列问题。(1)利用胡萝卜根段进行组织培养可以形成试管苗。用分化的植物细胞可以培养成完整的植株，这是因为植物细胞具有___________。(2)步骤③切取的组织块中要带有形成层，原因是_____________。(3)从步骤⑤到步骤⑥需要更换新的培养基，其原因是___________________________________________________________________________。在新的培养基上愈伤组织通过细胞的________过程，最终可形成试管苗。(4)步骤⑥要进行照光培养，其作用是________________________________________________________________________________________________。(5)经组织培养得到的植株，一般可保持原品种的________，这种繁殖方式属于________繁殖。[解析](1)植物细胞具有全能性，利用已分化的植物细胞通过植物组织培养可以培养成完整植株。(2)形成层细胞分化程度低，全能性较高，更容易诱导形成愈伤组织，进而获得完整植株。(3)愈伤组织的形成和试管苗的分化需要不同的生长素与细胞分裂素比例，因此诱导愈伤组织的形成阶段到分化阶段需要不同的培养基。愈伤组织通过再分化过程，最终可形成试管苗。(4)叶绿素的形成需要光，试管苗的发育也需要光，因此试管苗的诱导阶段需要光照。(5)通过植物组织培养获得植株的方式是无性繁殖的一种，可以保持原品种的遗传特性。[答案](1)全能性(或形成完整植株所需的全部基因)(2)形成层容易诱导形成愈伤组织(3)诱导愈伤组织形成和诱导愈伤组织分化形成试管苗所需的生长素和细胞分裂素的比例不同分化(或再分化)(4)诱导叶绿素的形成，使试管苗能够进行光合作用(5)遗传特性无性考点2植物体细胞杂交技术1．植物体细胞杂交(1)原理：体细胞杂交利用了细胞膜的流动性，杂种细胞培育成杂种植株利用了植物细胞的全能性。(2)操作流程(3)意义：克服不同种生物远缘杂交的不亲和性。2．植物体细胞杂交与植物有性杂交中遗传物质的变化设白菜细胞含2x条染色体，2个染色体组；甘蓝细胞含2y条染色体，2个染色体组。项目不同物种体细胞杂交不同物种有性杂交同一物种杂交过程子代染色体数目2x＋2yx＋y2x(白菜)或2y(甘蓝)子代染色体组数422子代是几倍体异源四倍体异源二倍体同源二倍体子代是否可育可育不可育可育1．两种远缘植物的细胞融合后会导致一方的染色体被排出。若其中一个细胞的染色体在融合前由于某种原因断裂，形成的染色体片段在细胞融合后可能不会被全部排出，未排出的染色体片段可以整合到另一个细胞的染色体上而留存在杂种细胞中。依据该原理，将普通小麦与耐盐性强的中间偃麦草进行体细胞杂交获得了耐盐小麦新品种，过程如图所示，下列说法错误的是()A．过程①需使用纤维素酶和果胶酶处理细胞B．过程②的目的是使中间偃麦草的染色