DB37-T 4362-2021 流感病毒与犬瘟热病毒双重荧光RT-PCR检测方法

ICS11.220CCSB41ICS11.220CCSB41山 东 省 地 方 标 准DB37/T4362—2021RT-PCR测方法Duplexreal-timeRT-PCRdetectionmethodforinfluenzavirusandcanineDuplexreal-timeRT-PCRdetectionmethodforinfluenzavirusandcaninedistempervirus2021031120210411山东省市场监督管理局发布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。流感病毒与犬瘟热病毒双重荧光RT-PCR检测方法范围RT-PCR（GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫本文件没有需要界定的术语和定义。本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应RNA：核糖核酸PBS：磷酸盐缓冲生理盐水5试剂或材料GB/T6682使用无RNA酶的容器进行分装。TRIzol，2～80.1DEPC氯仿，445.675A.3，应-20TEA.4——阳性对照：带有流感病毒M基因和犬瘟热病毒N基因的质粒。——阴性对照：为已知流感病毒和犬瘟热病毒阴性的动物组织悬液。PCR（）13000r/min。6.3冰箱，2～8-205μL、10μL、100μL1000μL。1.5mL样品121℃，15min——棉拭子；——剪刀、镊子；1.5mL——研钵或组织研磨仪。有咽喉拭子样品和肛门拭子样品：3～51.0mLPBS1.5mL肛门拭子采样，采样时将拭子深入肛门转一圈并沾取少量粪便；然后将拭子插入装有1.0PBS1.5mL用无菌剪刀、镊子采集不少于2.0g的肺脏等组织脏器，装入一次性自封袋或其它灭菌容器，编号备用。h302.010mLB4300r/in离心15min1.5mL或者用专用仪器设备处理待检组织样品。2℃824h0冻急性感染且出现病毒血症的动物可采集全血分离血清或血浆进行检测。荧光RT-PCRGB19489和GB/T274012504RNA样品病毒核酸RNARNARNA1.5mL200TRIzol110min200μL10min413000r/min15min（10min413000r/min15min1.0mL7548000r/min、10min5min50μLTERNA，-20RNARNART-PCRPCR+1+2μL荧光RT-PCR反应液。按B.2配制反应液，为避免移液器取样损失，建议按n+1个反应PCR20μL，加样在样品处理区进行。分别向上述PCR管中加入样本核酸提取步骤8.2.7中制备的RNA溶液各5μL，盖500r/min30RT-PCRPCRPCR/1594℃/3/15℃/10℃/30共40402min60PCRFAMCy5CtCt28。注：Ct阴性双检测通道均无Ct值，且无特征性扩增曲线，表明样品中无禽流感、犬瘟热病毒核酸。阳性犬瘟热病毒的核酸。9.3.2.2犬瘟热病毒的核酸。9.3.2.2FAMCt30.0Cy5CtCy5Ct30.0FAMCt9.3.3可疑Ct30.0～38.0附录A（0.5mol/LTris-HCl(pH8.0)称取6.055gTris100mL80mL0.1%DEPCHClpH值至8.0100mL，0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液称取18.61gNa2EDTA·2H2O置于100mL烧杯中，加入80mL0.1%DEPC水，用10NaOH溶液，调节pH8.0100mL75量取75mL25mL0.1DEPCTE将0.5mL10mmolTris-HCl(pH8.0)、0.1mL的0.5mol/LEDTA(pH8.0pH8.0，加0.1%DEPC50mL，4附录B（资料性）引物探针序列及荧光RT-PCR反应液配方引物和探针序列表见表B.1。表B.1引物和探针序列表病毒名称序列名称序列流感病毒上游引物ACCAGTCAACAAACTCCACAG下游引物GATTTGTTGCACACAGCATTCC探针FAM-GATTTGTTGCACACAGCATTCC-BHQ犬瘟热病毒上游引物GCAAGCGAGGATTGAGGGTAT下游引物GGCCTATGGGACACACTCAAA探针Cy5-CACCGACCATCCAGACGTTGCTCCT-BHQRT-PCR荧光RT-PCR反应液配方见表B.2。表B.2荧光RT-PCR反应液配方组分1个检测体系的加入量5×RT缓冲液5.0μLM-MLV反转录酶(200U/μL)0.5μLdNTPs(10mmol/L)1.0μLMgCl2(25mmol/L)3.0μL流感病毒上游引物(10μmol/L)0.5μL流感病毒下游引物(10μmol/L)0.5μL流感病毒探针(10μmol/L)0.5μL犬瘟热病毒上游引物(10μmol/L)0.5μL犬瘟热病毒下游引物(10μmol/L)0.5μL犬瘟热病毒探针(10μmol/L)0.5μLRNA酶抑制剂(40U/μL)0.25μLExTaqHS酶(40U/μL)0.25μLDEPC水7.0