DB45-T 2180-2020甘蔗黄叶病毒检测技术规程-（高清可复制）

ICS65.020.20B16

DB45广西壮族自治区地方标准DB45/T2180—2020甘蔗黄叶病毒检测技术规程Technicalcriterionfordetectionofsugarcaneyellowleafvirus2020-10-292020-11-30广西壮族自治区市场监督管理局发布DD4/122前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由广西壮族自治区糖业办公室提出并监督实施。本文件由广西糖业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所、广西甘蔗遗传改良重点实验室。本文件主要起草人员：魏春燕、覃振强、韦金菊、宋修鹏、张小秋、李德伟。IIDD4/122DD4/1225组织免疫印迹法检测甘蔗黄叶病毒检测技术规程1范围本文件规定了甘蔗黄叶病毒检测技术规程的样品采集与存放，组织免疫印迹法检测和一步法RT-PCR检测的原理、仪器与设备、试剂、操作步骤和检测结果的判定。本文件适用于甘蔗黄叶病毒的快速检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。下列术语和定义适用于本文件。3.1+1叶topvisibledewlapleaf甘蔗植株最高可见肥厚带叶。4样品的采集与存放4.1采样工具砍刀、剪刀、镊子等采样工具应经1211.1×10Pa高压灭菌15min或经1602h。采样方法采样前和采样过程中应避免样本交叉污染，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套。甘蔗植株采样：取甘蔗植株的+115cm甘蔗蔗种采样：取中部种茎，编号保存备用。4.3运送和存放4.3.12℃～8运送；运到实验室后应在47d。4.3.2RT-PCR2℃～8424801原理将待测的样品印迹在固相载体硝酸纤维素膜上，用病毒的特异性抗体与吸附在固相载体上的病毒进行特异性反应，再与碱式磷酸酶标记的第二抗体进行反应，最后用碱式磷酸酶的反应底物硝基酚磷酸片进行显色反应，根据颜色的变化，确定病毒的感染程度。仪器与设备圆周式摇床：可调振荡速50rpm～300rpm。普通光学显微镜：放大倍数范40X～1600X。电子天平：0.1g。硝酸纤维膜、酒精灯、手术刀、载玻片、培养皿。试剂除另有规定外，所用试剂均为分析纯或生化试剂；实验室用水GB/T6682二级水指标，其中涉PCR符合一级水指均用灭菌的容器分装配制好的4℃条件下保存。甘蔗黄叶病毒单克隆抗体。碱性磷酸酯酶标二抗。硝基酚磷酸片（BCIP/NBT）。TBS-T（pH三羟甲基氨基氯化g，吐温-20（Tween-20）5mL,用蒸馏水溶解并定容1000mL，pH7.5进行高温灭菌，冷却后保存备用。2％脱脂奶粉TBS-T封闭液：称2g100mLTBS-T缓冲液配制2％脱脂奶粉的TBS-T封闭液，现配现用。1％脱脂奶粉TBS-T缓冲液：称1g50mLTBS-T缓冲液配制2％脱脂奶粉的TBS-T封闭液，现配现用。标准样品：——阳性对照：用已知含甘蔗黄叶病毒的样品作阳性对照；——阴性对照：用已知不含甘蔗黄叶病毒的样品作阴性对照。5.4操作步骤样品制备从4℃冰箱中取出材料75％酒精进行叶片表面消选取叶中脉火焰消毒的解剖刀切叶中脉并把新鲜切口垂直印在硝酸纤维膜上，保持5s～6s至硝酸纤维膜出现清晰完整的印迹，每个3次重复印迹，印好的膜在室温下自然风干10min～15min后置于4℃冰箱保存备用。将印好的硝酸纤维膜置于盛有2％脱脂奶粉的TBS-T封闭液的培养皿封闭液的用维膜为宜，置培养皿于转速为50rpm的水平摇床，室温下孵育40min～60min。2第一次洗涤用TBS-T缓冲液洗膜3每次5在50rpm的水平摇床上进行证膜可以完全洗脱干净5.4.2.3第一次孵育将清洗后的膜转入含有1％脱脂奶粉的TBS-T缓冲液的培养皿中，同时在缓冲液中加入特异性抗体（抗体稀释比例为1:7000），在室温下孵育3h或4℃静置过夜，室温孵育时在转速为50rpm的水平摇床上进行。同5.4.2.2。第二次孵育将清洗后的膜转入含有1％脱脂奶粉的TBS-T缓冲液的培养皿中，同时在缓冲液中加入含有碱式磷酸酶标记的二抗（抗体稀释比例为1:2000），在室温下孵育3h，孵育时在转速为50rpm的水平摇床上进行。同5.4.2.2。显色和终止将清洗将清洗后的膜转入显色液（每片硝基酚磷酸片溶于10mL蒸馏水）中，在5min～10min内观察，待阳性对照显示清晰的紫蓝色时，将膜转入蒸馏水中使之终止反应。5.5检测结果的判定5.5.1判定依据检测过程中分别设定阳性对照和阴已知含有甘蔗黄叶病毒的样品作阳已知含甘蔗黄叶病毒的样品作阴性对照，判定依据如下：——阴性对照：样品印迹在膜上未显示有任何紫蓝色；——阳性对照：样品印迹在膜上显示有清晰的蓝紫色。5.5.2阴性样品印迹在膜上未显示有任何紫蓝色，表示样品中不含甘蔗黄叶病毒。5.5.3阳性样品印迹在膜上显示有清晰的蓝紫色，表示样品中含甘蔗黄叶病毒。6一步法RT-PCR检测3DD4/122DD4/122原理经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或RT-PCR反转录和PCR在同时为反转录和PCR的优在同一支管中顺次进行。仪器与设备普PCR电子天平：0.01g。高速台式冰冻离心机：最15000g。组织研磨仪。水平电泳系统。凝胶成像系统。6.2.7微量移液μL～2.5μL～10μL～100μL～200μL～1000μL6.2.8RNA的离心管、PCR反应管、硝酸纤维膜、手术刀、载玻片、酒精灯。6.2.9冰箱：2℃～4℃，-20℃，-80℃。试剂植RNA提取试剂盒。RT-PCR扩增试剂盒。6.3.3DNA分子量标准物（100bp～2000bp）。DNA样缓冲液（6×DNALoadingBuffer）。检测引物:物SCYLVf1：5’-GACAGACTCGGCCAGTGGTCGTG-3’；物SCYLVr1：5’-GTAAGCCATTGTTGAACGCTGCG-3’；——扩增片段大小为219bp。50×TAE取三羟甲基氨基甲烷（Tris）242.2g300mL水加热搅拌溶解后，加100mL500mM/L乙二胺四乙酸（EDTA）的水溶液（pH8.0），用冰乙pH8.0，用蒸馏水定容到1000mL。1×TAE50×TAE储液直接用蒸馏水50倍稀释即得1×TAE，现配现用。6.3.8标准样品:同5.3.7。操作步骤总RNA取与组织研磨仪配套使用且内含2mL无RNA，并对每个管进行编号。取出冰箱中存放的样品材料剪碎混匀后称1g样品（蔗茎样品要去除表皮）转至离心管，并0.9mL提取试剂盒中配RNA提取液。将离心管置于组织研磨仪上震荡粉2min，取出离心管并置4℃、12000g10min吸取上清液至另一不含2mL无RNARNA提取试剂盒推荐的操作方法完RNA的提取，提取完RNA于冰上RNA应2hRT-PCR扩增；若需长期保存，应放置-80℃冰箱。4PCR以样品、阴性和阳RNA，并以超纯水为空白对照模板；选RT-PCR试剂盒在同PCR反应管内进行反转录PCR扩增，具体步骤按照试剂盒推荐的操作方法进行。6.4.2.2从试剂盒RT-PCR反应液，在冰上融化后，2000g5s。每个测试样本反应混合液配制参见表1。表1每个测试样本反应混合液配制的组分及使用量试剂使用量25μL反应体系终浓度5×反应缓存液5.00μL1×10mmol/LdNTPs0.50μL0.2mmol/LSCYLVf1（10μM）1.00μL0.4μmol/LSCYLVr1（10μM）1.00μL0.4μmol/L10U/μLRNAase抑制剂0.25μL2.5U/25μLDEPC水15.25μL/RT-PCRMix1.00μL/模板RNA1.00μL/总体积25μL/根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，全部加完后，充分混合均匀，2000g5s，向每个做好标记PCR管中各分24.0μL。向各个标记好PCR管中分1.0μLRNA盖紧管盖微g30s将加PCR管放PCRPCR反应条件后开始程序。PCR反应程序为：50℃进行cA成3in5℃预变性5in进行5次扩增（9℃变性1in1火1mn72℃延30s）；7210min。反PCR反应管并4℃条件下保存。扩增产物的电泳检测称取适量琼脂糖加入1×TAE缓冲液中，加热至完全溶解，配制成1.5％的琼脂糖溶液；稍适冷却后倒板，室温下凝固成琼脂糖凝胶。分别2μL6×上样缓冲液5μLPCR扩增产物到PCR管，振荡混匀，2000g5s。分别将5μL的DNA分子量标准物和PCR产物混合液依次加入琼脂糖凝胶的点样孔后进行电泳电泳使用的电压80V，电泳时间30min。凝胶成像分析将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统成像仪，根据DNA分子量标准物判断扩增出的目的条带大小，泳结果用拍照系统拍照形成图片文件存档。检测结果的判定5判定依据检测过程中分别设定阳阴已知含有甘蔗黄叶病毒的样品作阳用已知不含甘蔗黄叶病毒的样品作阴性对照；用等体积的无RNA酶的水代替模板作空白对照，判定依据如下：——空白对照：无任何目的扩增条带；——阴性对照：219bp小的目的扩增条带；——阳性对照：出现219bp小的目的扩增条带。6.5.2阴性无219bp大小的目的扩增条带，表示样品中不含甘蔗黄叶病毒。6.5.3