口腔培养细胞的取材与分离

培养细胞的取材与别离取材部位准确严格无菌操作，防止微生物和化学污染尽快培养，24h以内减小损伤，使用锐器，防止撕扯制备标本，以便鉴定第一页，共三十页。体外细胞的纯化人工纯化：酶消化法、机械刮除法、反复贴壁法、克隆法、培养基限定法、流式细胞仪别离法等自然纯化第二页，共三十页。细胞冻存要点：冷冻过程要缓慢冻存细胞必须处在对数生长期细胞复苏要点：快速解冻解冻后的细胞应离心去除冷冻保护剂后再接种到培养基中第三页，共三十页。细胞培养的污染、检测与控制微生物污染：细菌，真菌，支原体等污染污染的途径：空气、器材、操作、试剂、组织标本微生物污染的检测微生物污染的控制：抗生素除菌法；加温处理第四页，共三十页。细胞培养常用方法：组织块培养法酶消化法第五页，共三十页。第二节口腔医学中相关细胞培养及其特点第六页，共三十页。一、牙齿相关细胞第七页，共三十页。牙髓细胞〔Dentalpulpcells〕培养方法：组织块法；酶消化法细胞形态特点免疫组织化学染色体外培养细胞的生长增殖特点功能特点第八页，共三十页。牙髓细胞波形丝蛋白染色(+)未分化间充质细胞成纤维细胞第九页，共三十页。牙髓细胞体外培养细胞的生长增殖〔Cellproliferationinvitro〕

生长增殖较快

传代期较短，15-20代(2-4M)

可复层生长第十页，共三十页。牙髓细胞功能特点

碱性磷酸酶〔alkalinephosphatase,ALP)活性矿化现象(VonKossa)对细胞因子的反响对盖髓剂的反响第十一页，共三十页。牙髓细胞培养方法：组织块培养法；酶消化法细胞形态特点：成纤维细胞型〔与牙周膜细胞类似〕免疫组织化学染色：波形丝蛋白〔+〕；角蛋白〔-〕体外培养细胞的生长增殖特点功能特点第十二页，共三十页。牙周膜细胞〔periodontalligamentcells〕培养方法：组织块法；酶消化法细胞形态特点免疫组织化学染色体外培养细胞的生长增殖特点功能特点牙周膜细胞增殖分化的影响因素原代人牙周膜成纤维细胞传代人牙周膜成纤维细胞第十三页，共三十页。

免疫组织化学染色波形丝蛋白染色阳性角蛋白染色阴性第十四页，共三十页。牙周膜细胞

成纤维样细胞，培养成功率高

细胞增殖快

体外存活时间长(4-12M)第十五页，共三十页。功能特点分泌功能：胶原、非胶原蛋白、碱性磷酸酶。矿化功能收缩功能再生功能根面吸附等第十六页，共三十页。二、唾液腺细胞第十七页，共三十页。细胞形态特点腺泡上皮细胞：体外培养的腺泡细胞多呈“铺路石〞样排列导管上皮细胞：导管上皮细胞呈多边形肌上皮细胞：肌上皮细胞呈梭形或星形唾液腺细胞第十八页，共三十页。导管上皮细胞HSG细胞系HSG细胞系第十九页，共三十页。A小型猪腮腺上皮细胞原代培养〔×10〕B小型猪腮腺上皮细胞alpha淀粉酶免疫组化染色〔×10〕腺泡细胞上皮细胞第二十页，共三十页。免疫组织化学染色腺泡上皮细胞：角蛋白、淀粉酶、对氨基水杨酸、导管上皮膜、前角蛋白、单克隆角蛋白、分泌成分阳性反响导管上皮细胞：角蛋白、上皮膜蛋白、磷酸酐酶抗体染色阳性反响肌上皮细胞：肌动蛋白、S-100蛋白、肌凝蛋白抗体染色阳性反响第二十一页，共三十页。三、口腔黏膜细胞第二十二页，共三十页。口腔黏膜细胞培养方法：组织块法和酶消化法形态特点：卵圆形、多边形，呈“铺路石〞样单层排列免疫组织化学染色：波形丝蛋白阴性，角蛋白阳性功能：分泌大量的胶原蛋白与非胶原蛋白第二十三页，共三十页。兔口腔黏膜上皮细胞ABA无血清培养基培养条件下〔×10〕B滋养细胞层培养条件下〔×4〕第二十四页，共三十页。四、颌骨相关的硬组织细胞第二十五页，共三十页。破骨细胞形态学特点：多核巨细胞，体积大组织化学染色：破骨细胞单克隆抗体呈阳性反响；降钙素反响呈蓝紫色；抗酒石酸磷酸酶反响呈棕褐色功能：骨吸收功能影响因素：促进：破骨细胞激活因子、甲状旁腺素抑制：γ-干扰素、降钙素第二十六页，共三十页。成骨细胞形态学特点：不同培养方法所获得的成骨细胞形态各有差异免疫组织化学染色特点：BGP、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶活性功能：成骨作用

调节破骨细胞骨吸收作用第二十七页，共三十页。五、口腔肿瘤细胞第二十八页，共三十页。口腔鳞癌细胞细胞系来源：鳞状细胞癌标本原代及传代培养生物学特性：

多角形上皮样细胞

核/浆比例高，多核仁

高贴壁率，克隆形成率和软琼脂集落形成率Cal27cell第二十九页，共三十页。内容总结培养细胞的取材与别离。传代期较短，15-20代(2-4M)。培养方法：组织块培养法。体外存活时间长(4-12M)。分泌功能：胶原、非胶原蛋白、碱性磷酸酶。导管上皮细胞：导管上皮细胞呈多边形。肌上皮细胞：肌上皮细胞呈梭形或星形。导管上皮细胞：角蛋白、上皮膜蛋白、磷酸酐酶抗体染色阳性反响。肌上皮细胞：肌动蛋白、S-100蛋白、肌凝蛋白抗体染色阳性反响。培养方法：组织块法和酶消化法。功能：骨吸收功能第三十页，共三十页。儿童休克的诊断与治疗思路LOREMIPSUMDOLOR正常的血液循环过程1.正常的血液循环过程血容量→心泵→血管→组织灌注→器官功能2.血压维持的三大要素有效循环血量心泵功能（心输出量）外周血管阻力3.收缩压、舒张压、脉压与平均动脉压收缩压：反应心肌收缩力与心搏量舒张压：反应大动脉弹性与外周血管阻力脉压：是一个计算值，收缩压与舒张压之差值平均动脉压：是一个计算值，1/3收缩压+2/3舒张压中心静脉压：反映循环容量符合与右心功能状况休克的定义

休克（shock）：是由多种致病因素引起的急性循环功能障碍，因有效循环血容量减少，使全身组织和重要器官血流灌注不足，集体不能输送足够的氧和营养物质、并去除代谢产物，从而导致一系列代谢紊乱、细胞损伤及脏器功能不全的急性临床综合征。在休克病程的不同阶段，有不同的矛盾特点：早期以有效循环血容量减少，心输出量减少，微循环障碍为主晚期以代谢紊乱、细胞损害和器官功能障碍为主最后发展至MODS，可致死亡。休克的本质组织器官血流灌注不足组织氧和营养物质利用障碍休克的病理生理过程1.休克的基本发病过程有效循环血容量不足→微循环障碍→MMDS→MODS2.休克的病理生理（早期）有效循环血容量减少心输出量减少微循环障碍（痉挛、扩张、麻痹、血栓、CLS）3.休克的病理生理（晚期）组织缺血缺氧代谢紊乱表现器官功能不全或衰竭→MODS（难治期）休克时血压与心输出量变化1.休克时收缩血压的状况升高正常下降2.休克时心输出量的状况升高正常下降休克的分类（一）根据病因学分类1.脱水性休克2.过敏性休克3.脓毒症休克（感染性休克）4.心源性休克5.神经源性休克6.失血性休克7.贫血性休克8.混合性休克休克的分类（二）根据血流动力学特点分类1.低血容量性休克（如脱水性休克、失血性休克）2.分布异常性休克（如脓毒症休克、过敏性休克、神经源性休克）3.心源性休克4.梗阻性休克5.贫血性休克6.混合性休克休克的分类（三）根据病程分期1.休克代偿期（休克早期）脏器低灌注血压正常或者偏高2.休克失代偿期（休克晚期）脏器功能不全，伴血压下降3.休克不可逆期（休克难治期）多脏器功能衰竭伴顽固性低血压休克的分类（四）根据临床表现分型1.暖休克：高排低阻。可有意识改变、尿量减少或乳酸性酸中毒等，但四肢温暖、皮肤干燥、无花斑纹，脉压增大，脉搏搏动有力，毛细血管再充盈时间正常，心率快，休克代偿期血压正常，失代偿期血压降低。多为休克早期，极容易漏诊，且可很快转变为冷休克。2.冷休克：低排高阻或者低排低阻。除意识改变、尿量减少外，还表现为皮肤苍白或花斑纹，四肢凉，脉搏增快、细弱，毛细血管再充盈时间延长（≧3s）。休克代偿期血压正常，失代偿期血压降低。儿科休克多为此型。脓毒性休克的定义脓毒性休克（septicshock）是发生在各种严重感染的基础上，由致病微生物及其产物所引起的急性循环功能障碍，有效循环血容量减少，使全身组织和重要器官的血流灌注不良，不能输送足够的氧和营养物质以满足组织代谢需要，从而导致一系列的代谢紊乱、细胞受损及脏器功能障碍的急性综合征。sepsis+急性循环功能障碍（顽固性组织低灌注，伴或不伴低血压）即为脓毒性休克。在脓毒性休克病程的不同阶段，有不同的矛盾特点：早期以有效循环血容量减少、心输出量减少、微循环障碍为主；晚期则以细胞损害、代谢紊乱和器官功能衰竭为主；最后发展至MODS，可致死亡。承认脓毒性休克2016年最新定义，指在脓毒症的基础上，经充分液体复苏后，仍持续低血压（需要升压药以维持平均动脉压≧65mmHg）且乳酸水平>2mmol/L。脓毒性休克诊断

根据儿童脓毒性休克诊治专家共识（2015版）（一）脓毒性休克代偿期：在下列各项脏器低灌注表现中，6项满足3项或以上+血压不下降者1.意识改变早期烦躁不安或萎靡，表情淡漠或嗜睡，晚期意识模糊，甚至昏迷、惊厥（多见于失代偿休克）2.心率脉搏改变心率、脉搏增快，外周动脉搏动细弱，外周动脉搏动可有力3.皮肤改变面色苍白或苍灰，肢端湿冷，大理石样花斑纹。如为暖休克可表现为四肢温暖、皮肤干燥、无花斑纹4.毛细血管再充盈时间（CRT）延长CRT≧3s（或>2s）（除外环境温度影响）。如为暖休克，CRT可正常。5.尿量减少充分液体复苏后，尿量<0.5ml/（kg.h）（无尿），持续至少2h；或者尿量<1ml/（kg.h）（少尿）6.乳酸酸中毒动脉血乳酸>2.0mmol/L（除外其他缺血缺氧以及代谢因素）脓毒性休克诊断

根据儿童脓毒性休克诊治专家共识（2015版）（二）脓毒性休克失代偿期：代偿期脏器低灌注表现加重+出现低血压（主要指收缩压）者<1月收缩压<60mmHg1-12月收缩压<70mmHg1-10岁收缩压<70+2×年龄（岁）mmHg≧10岁收缩压<90mmHg2.需要使用心血管活性药物才能够维持血压在正常范围（多巴胺>5ug/（kg.min））或任何剂量的多巴酚丁胺、去甲肾上腺素、肾上腺素等）脓毒性休克诊断

根据儿童脓毒性休克诊治专家共识（2015版）（三）脓毒性休克不可逆期（难治性）：多脏器功能衰竭血压明显持续下降，心音嫉妒低钝，严重心肌损害，严重心律紊乱，常合并心功能衰竭、肺水肿或ARDS、脑水肿、肾功能衰竭、胃肠道功能衰竭、DIC、严重的内环境紊乱与电解质紊乱（低钙血症、低钠血症等）等多器官功能衰竭表现。治疗难度极大，大多最终死亡。儿童危重症的基本处理原则（1）除告知病情危重，并做相应处理外，还应把我以下基本原则1.通道2.氧气3.盐水4.监护5.上级6.住院（PICU）7.强调病情变化，动态监测，即使评估，随时调整。儿童休克的治疗原则各种儿童休克治疗的基本原则1.早期、积极、持续，并采取综合治疗措施2.重症监护（包括血流动力学监测）与一般治疗3.抗休克治疗（液体复苏与心血管活性药物应用）4.器官功能饱和与支持对症治疗5.针对病因与基础疾病治疗6.基础治疗，如氧疗、镇静镇痛治疗，胃肠道减压治疗7.监测评估调整相统一脓毒性休克的治疗

脓毒性休克治疗的主要内容与方法重症监护（包括血流动力学监测）与一般治疗抗休克治疗（液体复苏与心血管活性药物应用）抗感染治疗及感染灶清除，并与抗炎治疗协同进行肾上腺皮质激素应用静脉大剂量免疫球蛋白治疗纠正凝血功能障碍与DIC连续血液净化治疗（肾脏替代治疗）器官功能保护与支持对症治疗（ECMO）维持内环境平衡与稳定危重症的营养支持治疗（暂禁食与静脉营养）基础治疗，如氧疗，镇静镇痛治疗，胃肠道减压治疗脓毒性休克的重症监护与一般治疗1.重症监护：生命体征、临床症状及实验室指标：a心电监护、SPO2监测以及动脉血气分析。bT、R、BP、意识改变、肢端温度、皮肤颜色、CRT、尿量、肝脏大小、心肺听诊等。c血常规、尿常规、血气、血乳酸、血糖、血电解质、肝肾功能、凝血功能指标、心肌损害指标、其他器官功能指标d炎症反应指标（如CRP、PCT、IL-6、铁蛋白等）e床旁胸片、彩超、心电图、脑电图等f病原学指标g无创或有床血流动力学监测与氧代谢指标监测h准确记录液体出量、入量脓毒性休克的重症监护与一般治疗2.合适体位：头部及双下肢抬高30°3.对症治疗：积极控制体温；四肢末梢保暖；亚低体温脑保护；保证气道畅通。4.基础治疗：氧疗（给予高流量鼻导管供氧或面罩氧疗，如鼻导管或面罩氧疗无效，则予无创正压通气，或尽早进行气管插管机械通气），胃肠道减压（如鼻胃管持续负压吸引减压/肛门直肠减压、灌肠/导泻、导尿），镇静镇痛肌松治疗，维持内环境平衡，营养治疗等。脓毒性休克的液体复苏（一）脓毒性休克液体复苏目的1.恢复有效循环血容量，即容量复苏。休克时微循环障碍，血液淤滞在微循环内，毛细血管通透性增加，血管内页渗漏到组织间隙，血流分布一场，有效循环血容量急剧减少，心输出量下降。因此患儿无论是否有额外体液丢失，液体复苏都是重要的治疗措施。且往往需要大容量液体复苏，液体入量远高于出量。由于血液重新分配及毛细血管渗漏等，脓毒性休克的液体丢失和持续低血容量可能持续数日。因此要继续和维持输液，应维持数日。2.恢复有效的器官血流灌注休克时，血流比血压可能更重要。3.纠正各种代谢紊乱，维持内环境平衡稳定如维持水电解质平衡、渗透压平衡、纠正代谢性酸中毒、维持血糖稳定（5个平衡）脓毒性休克的液体复苏

(二)脓毒性休克液体复苏原则1.及时充分液体复苏是逆转休克病情，降低病死率最关键的措施。2.迅速建立2条静脉或骨髓通道，条件允许应放置中心静脉导管。3.推荐更有利、更确定的液体复苏新策略，一旦诊断脓毒性休克，应竟快实施液体复苏，第1小时最重要。4.强调在监测下液体复苏，并评估病情（意识状态、皮肤颜色、肢端温度、CRT、心率、脉搏、血压、尿量、呼吸、肝大小、血气等）5.输液的剂量与速度取决于心肺功能及休克的不同阶段，要注意防止心力衰竭、肺水肿、CLS加重等。除上述常规临床指标监测外，有条件应进行无创或有创/静脉或动态血流动力学监测或氧代谢指标监测。6.规范化与个体化相结合，监测评估调整相统一。脓毒性休克的液体复苏（三）脓毒性休克液体复苏注意事项1.休克时，血流比血压可能更重要。儿童血压较低，并可通过血管收缩和增加心率加以代偿，以防止血压降低。因此儿童血压不是评价液体复苏复苏是否恰当的可靠指标。但是一旦血压降低于预示着将很快发生微循环功能衰竭。因此，不是等出现了低血压才进行液体复苏。2.第1小时快速输液阶段，既要重视液体量不足，又要防止容量复合过度。3.要注意肝脏大小及心肺听诊。肝脏增大提示容量负荷过度，可作为判明充分液体复苏的有用体征。被动直腿抬高试验（PLR）优势额代替CVP测定。容量负荷过度而血流动力学无改善时，应立即减慢液体输注速度或者停止快速输液，并及时给予利尿剂治疗，如呋塞米持续泵入。4.充分液体复苏无效时，要联合应用心血管活性药物。5.充分液体复苏后，可适时联合应用利尿剂如呋塞米。脓毒性休克的液体复苏（四）脓毒性休克复苏液体选择（尚存争议）1.等渗晶体液（0.9%氯化钠、林格氏液脓毒性休克的液体复苏早期不含糖、不含碱）2.胶体液（5%白蛋白、新鲜冰冻血浆、全血等）3.液体复苏是，用晶体液还是胶体液，目前学术上并无定论，应根据特定的复苏目的选择特定的复苏液体。晶体液价廉易得，且不良反应少，故普遍优先使用。一旦大量晶体液复苏疗效欠佳，或有明确低白蛋白血症时，可以适时、适当补充胶体液，如白蛋白等。晶胶兼顾，各尽其能，因人而异，灵活使用，有的放矢，缺什么补什么。4.关于3%或7.5%高渗盐水（无定论）与羟乙基淀粉的应用问题（不宜用）？5.血浆一般不作为容量复苏的胶体选择，其适应症主要为补充凝血因子。6.输血问题：当贫血较重（Hb<70g/L，HCT<30%），应酌情输注浓缩红细胞，使Hb>