酿酒酵母发酵生产腺苷蛋氨酸工艺幻灯片

酿酒酵母发酵生产腺苷蛋氨酸工艺产品价值腺苷蛋氨酸(SAM)是人体内最重要的甲基供体，在生命活动过程中，使得重要物质如核酸、蛋白质、脂类、碳水化合物等甲基化。同时，SAM也参与人体内的转氨丙基和转硫基等代谢反应，因此，SAM对人体许多疾病的预防和治疗，都有积极作用。临床应用

SAM使用安全，即使加大剂量也没有危险。临床研究刚开始时集中在腺苷蛋氨酸抗抑郁的方面，随后逐渐发现其对人体其它的一些疾病也具有治疗作用。抑郁症：SAM抗抑郁作用无剂量相关性，起效快，几乎无不良反应，耐受性好肝病：腺苷蛋氨酸对各种原因引起的肝功能异常有良好疗效关节炎：腺苷蛋氨酸与类固醇类抗炎药相比，不抑制前列腺素合成，也不会操作胃肠道，效果良好生产方式SAM可以由化学合成、体外酶促合成或微生物发酵三种途径得到。化学法合成由于产率低，反应底物L-高半胱氨酸价格昂贵，反应产物又为SAM的消旋物等明显缺点，已很少使用。体外酶法合成尽管产物纯度高，但成本也高，一般只用于合成同位素标记的SAM。而通过微生物发酵，再从中提取精制SAM是目前其工业化生产的主要途径。技术支持微生物工程（发酵工程制药）生产原理培养基组成间歇灭菌法空气过滤灭菌法产品分离纯化培养基组成1.碳源在酵母发酵生产SAM中，以蔗糖最佳，葡萄糖次之，乳糖最差。为降低成本，最终选择了7％的葡萄糖。2.氮源SAM发酵生产中最适氮源为，1％的酵母膏与1．4％的Urea以生产条件选择适合的氮源3.无机盐实验研究表明100％无机离子浓度即(0.4％KH2P04、0.2％K2HP04、0.01％MgS04·7H20、0.2％CaCL2·2H20)菌体的生长情况与产SAM的能力最好。4.微量生长因子考虑到实际工业生产中的成本问题，最后选择了以马铃薯淀粉废液代替微量元素的培养基配方。间歇灭菌法又称为分批灭菌，是指将培养基放在发酵罐内，然后连罐加热到规定的灭菌温度。间歇灭菌的操作过程分为3个过程：加热----保温维持----冷却。这些不同的阶段，均能够起到灭菌的作用。然而，在灭菌过程中，保温杀菌的作用是主要的，冷却杀菌的作用最小。优点：设备造价低廉、便于进行手动操作空气过滤灭菌法是指让空气通过过滤介质，以阻截空气中所含的微生物，取得无菌空气的目的。

空气过滤分为2种：（1）绝对过滤（2）深层过滤陶瓷过滤机产品分离纯化微生物的发酵产物是一种混合物，里面除了含有主要产物以外，还含有未能转化的基质和底物、残余的原料、大量的水、微生物细胞、各种杂质。因此，必须对发酵产物进行分离和纯化。

分离和纯化过程被称作“下游加工过程”，需要经过以下这几个阶段：

（一）固体物质的去除

（二）初步分离

（三）产品提纯

（四）产品的最终分离固体物质的去除（1）过滤法------分批过滤、连续真空过滤、错流流动过滤。

错流流动过滤法------使液体平等于过滤膜的表面进行流动，这样能够不断地移去在滤膜表面积累的细胞物质，从而获得近似于恒定的过滤速率。（2）离心分离法------垂直式离心、水平式离心。（3）沉降法------与一般的自由沉降不同，工业生产过程的沉降都属于干扰式沉降。常用的设备（1）过滤设备------板框过滤机、回转真空过滤机（2）离心设备-------转篮式离心过滤机（三足式离心过滤机）、刮刀卸料式离心过滤机、沉降式离心过滤机、喷雾离心过滤机、间断排料式离心过滤机、倾析式离心过滤机。（3）沉降设备------管式离心沉降机。不锈钢板框压滤机澄清型管式分离机SSC600-NG三足式沉降离心机19XKZ全自动压滤机固体物质的前期预处理技术由于生物反应液的粘度很大，直接分离往往比较困难，因此，常常对其进行预先的前期处理，来提高分离效果。常见的预处理技术有：

（1）使细胞老化凝聚成团，

（2）加热，

（3）改变PH值，

（4）添加化学物质促进凝聚，如加入高分子电解质、氯化钙、胶态粘士。初步分离进一步把已经分离的溶液浓缩，提高目的产物浓度的方法，称为初步分离。初步分离的具体方法可以分为：1、蒸发2、萃取3、沉淀4、膜分离1、蒸发蒸发是通过加热，使溶液中的水经过汽化除去要提高溶质浓度、为溶质的析出创造条件的一种操作方法。各种代谢物，如氨基酸、抗生素、酶都可以进行蒸发操作。由于生物产品大多数是热敏性物质，所以物料在蒸发器内的停留时间必须尽可能短，同时，还应该昼避免局部液体过热。LG系列离心式刮板薄膜蒸发器示意图蒸发设备

（1）连续流动膜式蒸发器，

（2）长管膜式蒸发器，

（3）强制膜式蒸发器，

（4）离心膜蒸发器。2、萃取萃取是通过物质在2种溶液之间不同的溶解度，来实现分离的操作方法。萃取的分类（1）有机溶剂萃取（2）双水相萃取（1）有机溶剂萃取许多抗生素都能够溶解在有机溶剂之中，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、因此，通过萃取，可使得抗生素从水相进入有机相之中，从而实现分离。由于抗生素在有机溶剂之中极不稳定，因此，在保证萃取效率的前提条件下，必须尽量缩短操作时间。有机溶剂萃取设备可使用Podbielniak离心萃取机。SFT-150超临界萃取反应仪利用萃取法来提取抗生素，具有质量好、收率高、速度快的优点。双水相萃取法，目前用于进行酶、和蛋白质的提取工艺。（2）双水相萃取使用2种互不相溶的高聚物，如聚乙二醇（PEG）、葡聚糖，分别将它们溶于水中形成双水相，利用目的产物在双水相中不同的分配系数而实现分离的方法，称为双水相萃取。萃取之后的目的产物可以通过超滤法进行提纯。双水相萃取材料--------（1）PEG--葡聚糖萃取系统，（2）PEG—磷酸钾萃取系统。3、沉淀蛋白质在溶液中具有“等电点”的特性，而且其等电点与溶液PH值有关，PH值大，蛋白质呈负电，PH值小，蛋白质呈正电，当PH=pI（等电点）时，蛋白质不带电荷。蛋白质在PI时的溶解度最小。这是因为蛋白质在水中有均匀分布是由于同性电荷相斥的缘故，当PH=pI时，由于蛋白质分子不带电荷，于是开始相互凝聚、产生沉淀。NSG-630浓缩分离机ZHN系列真空浓缩罐沉淀和盐折的结合由于沉淀常常导致蛋白质变性而失效。而利用盐溶液就能避免蛋白质的变性，这种方法就称为------盐析法。在不同的盐溶液之中，蛋白质有盐析效应有所不同。按下列顺序递减：

（1）阴离子------柠檬酸盐-3、酒石酸盐-2、SO4-2、F-、IO3-、H2PO4-、醋酸盐-、B2O3-、Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、ClO4-、CNS-。

（2）阳离子-------Th+4、Al+3、H+、Ba+2、Sr+2、Ca+2、Mg+2、Rb+、NH4+、K+、Na+、Li+。从离子物性来看，硫酸铵并不是盐析效应最强的盐类，但是由于它在水中的溶解度极大，对盐析十分有利，因此硫酸铵是目前最常用的盐析剂。4、膜分离膜分离技术是基于一种半透性薄膜，它能够使得溶液中的某些组分通过，而阻止和截留其它组分的分离方法。膜分离的优点

（1）由于膜分离是纯粹物质粒度大小这一几何特性来进行分离，它不必象萃取、沉淀法那样需加入其它化学物质、也不必象蒸发那样进行加热。因此，产物的生物学特性能够得到完好的保存，

（2）产物的损失量很少，有利于提高得率。膜分离的分类（1）反渗透法（2）超滤法（1）反渗透法根据物理化学的原理，当含有溶质A的溶液B与另一渗透液C之间被半透膜隔开的时候，由于系统渗透压的作用，渗透液C便会进入到溶液B之中，这种现象称为渗透现象。形成这种渗透的压力就自然称为渗透压（π）如果在溶液B一方施加压力（⊿P），发现渗透液C进入溶液B的速率就会减小。

当压力（⊿P）=渗透压（π）时，渗透现象就会停止。当压力（⊿P）>渗透压（π）时，就会看到溶液B开始反向进入渗透液C之中，这种现象就称为反渗透现象。根据溶液所具有的反渗透特性，可以实现溶液的浓缩。（2）超滤法是指在反渗透的基础之上，将隔离膜由原来的半透膜，改成带有较大孔径的薄膜。这样一来，在反渗透操作过程中，不但是溶剂进入到渗透液之中，就连那些许多小分子的杂质也连带一起进入到渗透液之中。

与反渗透法相比，超滤法明显具有其优点-------反渗透法只能起到浓缩作用，而超滤法在浓缩的同时，还具有纯化作用。反渗透法+超滤法的实际应用（1）主要用于蛋白质溶液的浓缩、脱盐等步骤，

（2）在疫苗、血浆等生产中也常被使用。

膜分离装置的分类

（1）中空纤维束，

（2）板-框膜分离装置，

（3）螺旋状膜分离装置反渗透装置产品提纯层析法，是指在一根层析柱内，填充某种特殊的载体物质，称为固定相。含有待分离产物的溶液则称为流动相。当流动相流过固定相的时候，由于流动相中不同的物质与固定相之间产生了不同强度的结合力，因此各种物质在层析柱内停留的时间也各不相同，结果，它们将依次序的先后流出层析柱。层析法的分类

1、吸附层析法

2、离子交换层析法

3、凝胶层析法（分子筛）

4、亲的层析法1、吸附层析法吸附层析法是利用各种物质与固定相之间由于吸附力的差异、而产生不同的结合力的原理，所进行的层析操作。固定相对溶质产生结合力，这种结合力是以离子键、氢键、范德华力所产生的。而流动相的洗脱作用又对溶质和固定相之间产生脱离作用。这样，吸附—脱离—再吸附—再脱离，导致溶质沿着洗脱液的方向移动。其移动速率取决于固定相对溶质的吸附能力，吸附力弱，移动就快，吸附力强，移动就慢。2、离子交换层析法（1）基本原理（2）离子交换过程（3）常用的离子交换树脂（4）离子交换层析法的应用（1）基本原理采用离子交换树脂作为固定相，离子交换树脂本身具有正离子基团和负离子基团，

酸性电离基团可以交换阳离子，称为阳离子交换树脂。

碱性电离基团可以交换阴离子，称为阴离子交换树脂。

离子交换树脂同时具备极性基团和非极性基团。极性基团不断地与溶液中的离子进行交换，而非极性基团则构成树脂分子的骨架，起支撑作用。（2）离子交换过程是一个同时包含吸附+吸收+穿透+扩散+离子交换+离子亲和，等等物理化学过程的综合作用的结果。溶液中的溶质离子扩散到树脂的表面溶质离子穿透树脂的表面扩散到树脂颗粒的内部溶质离子与树脂离子发生交换树脂离子穿透树脂的表面树脂离子扩散到溶液之中（3）常用的离子交换树脂（1）羧甲基纤维素阳离子交换树脂（CM-纤维素）------当阳离子蛋白质流经交换树脂时，由于静电吸引的作用，蛋白质将与树脂结合，然后用缓冲液进行冲洗交换柱，结合力最弱的蛋白质首先被洗脱下来。不同的缓冲液将各处洗脱“捡到”其中的某一蛋白质组分。（2）二乙氨乙基纤维素阴离子交换树脂（DEAE-纤维素）--------原理与CM-纤维素交换原理相同。（4）离子交换层析法的应用离子交换层析法具有收率高、质量好、周期短、成本低、设备简单、适合工业化生产等优点。目前已经普遍应用于生物化学制药行业。离子交换柱3、凝胶层析法（1）基本原理（2）常用的凝胶层析材料（3）凝胶层析的应用价值（1）基本原理凝胶层析也称为凝胶过滤、分子筛层析、排阴层析、凝胶渗透层析等等。凝胶是一种具有多孔的、网状结构的分子筛。每一个颗粒就相当于一个筛子。当样品通过凝胶层析柱时，分子量较大的物质由于直径大于凝胶网孔，它们沿着凝胶颗料的间隙流动，因此速度较快而首先流出层析柱。相反，分子量较小的物质可以自由地进出凝胶网孔，它们不断地在凝胶颗粒之中来回流动，从而导致进出速度下降。（2）常用的凝胶层析材料（1）葡聚糖凝胶，

（2）聚丙烯酰胺凝胶。AM90-1型凝胶层析仪（3）凝胶层析的应用价值（1）可用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸等物质。能彻底分离分子量相差只有25%的二种蛋白质。

（2）凝胶层析具有设备简单、分离迅速、不影响产物的分子生物学特性等优点。4、亲和层析法是利用生物分子之间所具有的专一亲和力而设计出的一种层析方法。（1）亲和层析的原理（2）亲和层析的例子

（1）亲和层析的原理（1）载体活化------将载体在碱性条件下用溴化氢（CNBr）进行活化。

（2）通过偶联反应制成亲的吸附剂-------将某一种能够与生物分子进行可逆性结合的物质（称作配基）通过偶联反应联结到载体上，

（3）含有生物分子的样品通过层析柱。

（4）生物分子与配基结合而被吸附，

（5）未能进行特异性结合的其它杂蛋白，通过洗涤而流出层析柱。（2）亲和层析的例子层析目的----分离DNA解聚酶层析方法----以珠状的琼脂糖、或者聚丙烯酰胺作为载体，以DNA解聚酶的抑制物作为配基层析结果----

（1）DNA解聚酶被特异性地结合在层析柱上，

（2）其它物质全部流出

（3）最后用适当的洗脱液通过层析柱，可获得纯度极高的DNA解聚酶工艺流程菌种

↓斜面培养斜面种子

↓摇瓶培养

摇瓶种子

↓种子罐培养2-3级

种子培养液

↓发酵罐培养

发酵液

↓过滤

滤液

↓阳离子交换树脂进行吸附交换

饱和树脂

↓洗脱

洗脱液

↓脱色、脱盐、浓缩

成品浓缩液

↓无菌过滤、干燥

成品菌种筛选出发菌种诱变育种平板分离菌种富集斜面培养一次发酵二次发酵保藏菌种A：斜面培养基：3％葡萄糖，1％酵母膏，1％蛋白胨，1.8％琼脂，0.4％KH2P04，0.2％K2HP04。灭菌条件121℃，20minB：种子培养基：3％葡萄糖，1％酵母膏，1％蛋白胨，0.4％KH2P04，0.2％K2HP04。灭菌条件121℃，20minC：发酵培养基：20％土豆培养液，7％葡萄糖，1％酵母膏，1％蛋白胨，1％L-Met，0.4％KH2P04，0.5％MgS04·7H20，0.2％K2HP04。灭菌条件121℃，20min前期发酵用紫外分光光度法分析检测SAM：测量条件：OD258nm，用1．5M高氯酸做对照空白后期发酵时则用高效液相色谱法测量液相条件：流动相为0.1M磷酸盐缓冲液-12％甲醇，pH7.0，流速为0.8mL／min，检测波长λ为258nm，液相柱为C18水相柱测量样品的制备：取1mL发酵液，在10000rpm，离心10min，用0.8％的生理盐水洗涤菌体2次，再加1．5M高氯酸1IIll进行细胞破碎处理1．5h，10000rpm离心，10min，取上清液用HPLC进行检测，产物浓度通过与标准品比较计算而得发酵流程斜面种子液添加补料菌体适应生长发酵罐下罐酵母菌的最佳摇瓶培养条件在28℃、初始pH5.0、l％LMet。最佳摇瓶发酵培养基20％土豆培养液，7％葡萄糖，1％酵母膏，1.4％Urea，l％L-Met，0.4％KH2P04，0．2％K2HP04，0.5％MgS04·7H20，0.2％CaCl2·2H20。种子培养基：3％葡萄糖，1％酵母膏，1％蛋白胨，0.4％KH2P04，0．2％K2HP04。发酵罐初始培养基(2L)：20％土豆培养液，7％葡萄糖，1％酵母膏，1．4％Urea，1％L-Met，0.4％KH2P04，0.2％K2HP04，0.5％MgS04·7H20，0.2％CaCl2·2H20。121℃下灭菌20min。其中Urea单独灭菌，在100℃灭菌10min。补料培养基：补料1(250m1)：25％．28％氨水，发酵罐自动补加并控制其流加速度，使pH保持在设定范围内。补料2(250m1)：80％磷酸，发酵罐自动补加并控制其流加速度，使pH保持在设定范围内。补料3(1L)：20％土豆培养液，35％葡萄糖，1％酵母膏，1.4％Urea，2％L-Met，0.4％KH2P04，0.2％K2HP04