血小板活化因子对人精子生物学活性和细胞外信号调节激酶的影响

血小板活化因子对人精子生物学活性和细胞外信号调节激酶的影响/r/n〔〕:/r/n

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/r/n摘要：目的血小板活化因子〔Platelet-activatingfactor，PAF〕促进精子受精潜能，从而/r/n进步/r/n受精率和临床妊娠率。/r/n方法/r/n通过FITC-PSA染色确定顶体状态、酪氨酸磷酸化检测、细胞外信号调节激酶活性(ERK)的检测来分别分析PAF对精子顶体/r/n反响/r/n、精子蛋白酪氨酸磷酸化及人精子ERK信号通路的作用。结果PAF处理显著(P0.1M的U0126预处理可显著并且剂量依赖性地抑制了PAF诱导的人精子顶体/r/n反响/r/n〔P/r/n

/r/n1材料和/r/n方法/r/n

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/r/n1.1精液/r/n搜集/r/n和精子准备/r/n

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/r/n本研究已获香港大学伦理委员会小组批准。精液样本取自就诊香港玛丽医院亚生育科诊所的男性。/r/n搜集/r/n前须先/r/n获得/r/n书面同意书。研究使用的精液均/r/n符合/r/nWHO精液参数正常/r/n标准/r/n(WHO，1998)。/r/n

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/r/n精液液化完全后，采用上游法于精液中别离精子(WHO,1998)。简而言之，将1.2mLEBSS/0.3%BSA轻轻置于1mL精液样本之上，置于15mL无菌锥形离心管中。试管斜置45°，于37℃，5%CO2孵育1小时。然后轻轻地回到直立的位置。仔细/r/n搜集/r/n最上层1mLEBSS/0.3%BSA,300g离心10分钟。/r/n搜集/r/n到的球团经过两次洗涤后，重悬于EBSS/3%BSA过夜放置以获能。除非另有/r/n说明/r/n，本研究使用的所有样本均为获能精子。实验当天，取500g离心5分钟，重悬于EBSS/0.3%BSA中。/r/n

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/r/n1.2通过FITC-PSA染色确定顶体状态/r/n

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/r/n如前文所述/r/n进展/r/n荧光素异硫氰酸酯标记的花生〔Pisumsativum〕凝集素〔FITC-PSA〕〔Sigma，U.S.A.〕和Hoechst染色[14]。将处理过的精子样品在5l磷酸盐缓冲盐水〔PBS〕含有0.05gsupravital染色剂Hoechst33258〔双苯甲亚胺;Sigma〕构成的染色溶液中温育15分钟。其后，在1mL2%〔w/v〕聚乙烯吡咯烷酮-40的PBS〔pH7.4〕溶液中以900g离心10分钟洗去样品中染料。重悬精子沉淀，并在300l95%乙醇中4℃放置30分钟。使用95%乙醇将最终精子浓度调节至10-20x106个/mL。将精子涂在载玻片上，室温风干。随后将载玻片用含有2gFITC-PSA的染色溶液在20lPBS中染色30分钟，蒸馏水洗涤两次并固定在含有0.2M正丙基丙酸酯〔Sigma，U.S.A.〕的甘油中。/r/n

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/r/n在400倍放大的荧光显微镜下对至少200个随机选择的精子/r/n进展/r/n定量。使用精子活力和顶体状态对精子/r/n进展/r/n评分。由于Hoechst染色在与DNA结合时表现出强烈的蓝色荧光信号，故具有强Hoechst染色〔Hoechst阳性〕的精子被认定为死亡精子。FITC-PSA那么作为顶体外膜存在的标志。根据凝集素染色/r/n形式/r/n可对顶体状态/r/n进展/r/n分类：〔i〕/r/n完好/r/n顶体：顶体的完全染色;〔ii〕/r/n反响/r/n中顶体：顶体/r/n局部/r/n或斑片状染色，无Hoechst染色;〔iii〕/r/n反响/r/n后顶体：赤道区染色或整个精子头未见染色，无Hoechst染色。/r/n

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/r/n使用cell-UV一次性精液分析室(FertilityTechnologies,Inc.，Natick,MA)结合计算机辅助精子分析(CASA)系统(美国Hobson精子追踪系统)分析精子活力。每次测量均在37℃的加热显微镜下/r/n进展/r/n，10分钟内完成。设置的参数系统有:〔i〕成帧率：60Hz，〔ii〕纵横比：1.39，〔iii〕校准：10.0，〔iv〕刷新时间：5s，〔v〕阈值+20/-20，〔vi〕滤波器重量：1，-1;2,0;3,0;4,0，〔vii〕最小室深度：20m，〔viii〕最小轨迹点：25，〔ix〕最大轨迹点：250，〔x〕轨迹绘制时间：3秒。对于每次评估，对来自随机选择的区域的200个精子/r/n进展/r/n定量。CASA系统根据/r/n以下/r/n参数测量精子活力：/r/n

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/r/n〔1〕曲线速度〔VCL;m/s〕-精子头沿曲线/r/n途径/r/n挪动/r/n的平均速度。/r/n

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/r/n〔2〕直线速度〔VSL;m/s〕-精子头在其第一个和最后一个检测位置之间线性/r/n挪动/r/n的平均速度。/r/n

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/r/n〔3〕线性度〔LIN;%〕-沿曲线/r/n途径/r/n的线性运动的度量，表示为VSL/VCL。/r/n

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/r/n〔4〕鞭打频率〔BCF;Hz〕-曲线/r/n途径/r/n与平均/r/n途径/r/n相交的平均速率。/r/n

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/r/n〔5〕头侧摆幅度〔ALH;m〕-精子头部偏离其平均/r/n途径/r/n轴线的幅度。/r/n

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/r/n1.3酪氨酸磷酸化检测/r/n

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/r/n取浓度为2x106/mL的精子，600g离心10分钟，1.5mLTBS冲洗一次。精子团重悬于裂解缓冲液(Cytobuster,Novagen)，参加蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Calbiochem)，室温孵育1小时。样品以20,000g离心10分钟后，仔细/r/n搜集/r/n上清，煮沸5分钟后，使用10%凝胶在Mini-PROTEIN3ElectrophoresisSystem(BioRad)中/r/n进展/r/nSBS电泳。凝胶在恒压115V的聚氯乙烯氟化膜(Millipore,Bedford,MA)上印迹75分钟。然后使用专为酪氨酸磷酸化设计的单克隆抗体(PY20,Sigma)/r/n进展/r/nWesternblot分析，随后使用与碱性磷酸酶(Novagen)结合的山羊抗小鼠IgG/r/n进展/r/n免疫印迹分析。采用多克隆抗微管蛋白抗体(Sigma)检测各泳道的加载样本。/r/n

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/r/n1.4细胞外信号调节激酶活性(ERK)的检测/r/n

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/r/n实验处理后的精子(10x106个/mL)使用PBS冲洗三次。精子蛋白在50l的蛋白提取缓冲液〔CentobusterTM，Calbiochem，CA，USA〕中用蛋白酶抑制剂混合物〔Calbiochem〕在室温下提取1小时。20000xg离心10分钟后/r/n搜集/r/n上清液，随后用12%SDS对精子溶解液/r/n进展/r/n分解，并在PVDF膜上/r/n进展/r/n印迹。采用单克隆抗活化ERK抗体〔克隆MAPK-YT，0.5g/mL；sigma〕/r/n进展/r/nWesternblot分析，随后用山羊抗小鼠二级抗体结合辣根过氧化物酶/r/n进展/r/n检测。采用抗微管蛋白抗体(Sigma)检测每个泳道的加载样本。非放射性ERK1/2活性测定试剂盒(Chemicon,Temecula,usa)也被用来根据制造商的/r/n说明/r/n确认Westernblot的结果。结果以未治疗组与对照组/r/n比拟/r/n的百分比变化表示。/r/n

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/r/n1.5统计分析/r/n

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/r/n结果用均数SEM(均数/r/n标准/r/n误差)表示。数据均采用统计软件/r/n进展/r/n分析(SigmaPlot8.02/r/nSigmaStat2.03,JandelScientific,SanRafael,USA)。所有实验均采用多重/r/n比拟/r/n秩检验的非参数方差分析。在适当的情况下，使用参数学生t检验或非参数MannWhitneyU检验作为后检验。P0.1M的U0126预处理可显著并且剂量依赖性地抑制了PAF诱导的人精子顶体/r/n反响/r/n〔P/r/n

/r/n3讨论/r/n

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/r/nPAF是一种乙酰化甘油磷脂，在许多细胞类型中具有多种生物学功能【3】。其参与调节如白细胞功能、血小板/r/n聚集/r/n和脱颗粒以及炎症等生物活性[15]，在排卵、卵母细胞受精、胚胎早期发育、着床、分娩等生殖过程中的作用也得到了广泛的研究。此外，PAF在调节精子功能方面发挥着至关重要的作用。内源性PAF浓度与人精子受精潜能及妊娠结局相关[18]。近期的研究说明，采用外源性PAF处理的精子可显著/r/n进步/r/n体内妊娠率，并增强精子在体外对无透明带仓鼠卵的穿透/r/n才能/r/n[19]。此外，用PAF处理的精子受精的卵母细胞可改善囊胚的形成和发育[20]。/r/n

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/r/n本研究的数据说明PAF对人类精子顶体/r/n反响/r/n率具有剂量依赖性影响。PAF处理精子90分钟可诱导酪氨酸磷酸化并激活ERK信号通路，对精子运动的影响最小，并且ERK抑制剂U0126可显着阻断PAF诱导的顶体/r/n反响/r/n。然而，作为PAF前体的Lyso-PAF对顶体/r/n反响/r/n和精子活力无明显影响。/r/n

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/r/n我们的研究结果与既往的发现一致，即PAF可促进人类精子的获能和顶体/r/n反响/r/n[21]。在一项研究的26份样本中，有20份在/r/n承受/r/n10nMPAF治疗后，顶体/r/n反响/r/n率显著升高，并可被PAF拮抗剂抑制[22]。此外，有研究显示人精子中PAF浓度与精子穿透/r/n才能/r/n呈正相关，反之亦然[18]。也有报道称，PAF诱导获能精子的顶体/r/n反响/r/n，但对未获能或无钙培养基中的精子无影响[23]。虽然我们目前的研究说明，Lyso-PAF并不能诱导顶体/r/n反响/r/n，但有一项研究显示，Lyso-PAF处理对顶体/r/n反响/r/n的诱导和人精子的穿透率有积极作用[24]。/r/n

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/r/n我们研究的初步结果说明，PAF处理精子90分钟对精子活力没有任何影响。然而，之前的研究结果却显示PAF浓度与精子活力之间存在正相关关系。对恒河猴精子的研究显示内源性PAF浓度与精子活力和进展相关【6】。据报道，PAF治疗可增加运动精子的数量和冷冻精子的运动参数[25,27]。PAF治疗4小时后，25份精子样本中有16份活力增加，并且过夜治疗后增强了所有精子样本的运动性[22]。GrassiG等人报道外源性使用浓度为0.1M的PAF持续治疗60分钟可显着/r/n进步/r/n精子活力。此外，用PAF受体拮抗剂CV-3988治疗24小时表现出对精子活力的抑制和可逆作用[26]。因此，PAF对精子活力的调节作用可能与/r/n埋伏/r/n期的持续时间有关。/r/n

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/r/nPAF受体位于人类精子的中段和近端头部[29]。PAF与人精子外表互补受体的结合/r/n互相/r/n作用诱导肌醇三磷酸的形成，通过刺激细胞内钙的释放，促进外源钙通过质膜钙通道的流入，增加细胞内钙浓度[30,31]。细胞内钙浓度升高可诱导膜间肌动蛋白网络解聚，从而激活与顶体/r/n反响/r/n相关的磷脂酶。PAF拮抗剂和PAF受体抗体可抑制精子活力、顶体/r/n反响/r/n率和精子穿透卵母细胞的/r/n才能/r/n[23,35]。酪氨酸磷酸化/r/n涉及/r/n精子功能的各个方面，包括顶体/r/n反响/r/n和精子-透明带结合[11]。获能过程中，酪氨酸磷酸化蛋白从非获能性精子的尾部移位到获能或透明带暴露的精子的顶体区域[11]。本研究结果说明，PAF诱导的人精子蛋白酪氨酸磷酸化可能与顶体/r/n反响/r/n率的正向影响有关。/r/n

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/r/n细胞外信号调节激酶〔ERK〕属于丝裂原活化蛋白激酶〔MAPK〕信号传导途径家族。原型ERK级联主要由Raf〔MAPK激酶激酶〕、MEK1/2〔MAPK激酶〕和ERK〔ERK1和ERK2〕组成[36]。Raf启动MEK的磷酸化，其反过来使ERK1和ERK2磷酸化〔ERK1和ERK2也称为p44和p42MAPK〕。我们的研究结果证实，PAF通过促进ERK1和ERK2的/r/n表达/r/n激活人精子中的ERK信号通路。/r/n

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/r/n值得注意的是，ERK拮抗剂U0126治疗降低了PAF诱导的顶体/r/n反响/r/n，而对自发顶体/r/n反响/r/n没有影响。结果说明，PAF可通过激活ERK通路/r/n进步/r/n顶体/r/n反响/r/n率。/r/n

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/r/nERKs定位于人精子顶体后区，并在顶体/r/n反响/r/n时重新分布于赤道区[37]。ERK级联在精子顶体/r/n反响/r/n调控中的作用尚不明确。先前的研究说明，ERK通路参与了精子活力的/r/n进步/r/n、头状位的形成以及PKC介导的顶体/r/n反响/r/n[37-39]。在体外获能期间，ERK1和ERK2以时间依赖性方式被酪氨酸磷酸化[37]。MAPK抑制剂PD098059能显著抑制透明带、钙离子团A23187和孕酮诱导的顶体/r/n反响/r/n[13]。另一方面，有研究报道ERK活化与精子受精潜能降低有关。据报道，ERK1/r/n表达/r/n的增加与精子质量低下有关。ERK的下调可增强人类精子中透明带诱导的顶体/r/n反响/r/n[13]。综上所述，ERK对PAF诱导的顶体/r/n反响/r/n确实切作用有待进一步研究。/r/n

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/r/nPAF明显存在于人类精子中。PAF活化酶(PAF-乙酰转移酶)和失活酶(PAF-乙酰水解酶)在哺乳动物精子和精液中都有/r/n丰富/r/n的/r/n表达/r/n[41]。这提示附睾液中PAF-乙酰水解酶的存在可使精子中的PAF失活，/r/n防止/r/n其过早获能。当射精的精子通过女性生殖道时，PAF被激活并随后启动生物活动，引起精子活力、顶体/r/n反响/r/n和精子与卵母细胞的/r/n互相/r/n作用增强[23,27,44]。/r/n

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/r/n总之，PAF诱导精子顶体/r/n反响/r/n和酪氨酸磷酸化。PAF对精子顶体/r/n反响/r/n的积极作用可能是通过ERK信号介导的。我们的研究结果进一步验证了PAF对人类精子受精/r/n才能/r/n的潜在作用。/r/n

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/r/n参考文献/r/n

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