维生素B12检测试剂盒和方法及其样本前处理方法发明专利

B12技术领域B12和方法及其样本前处理方法。背景技术B12B12B族维生素中迄今为止发现最晚的一种。维生素B12的结构如下所示：具有咕啉环一个类似为卟啉环的结构4N4结构的一个N吲唑与咕啉环之间由异丙5'脱氧腺苷连接；5.ROH、Cl、CN等带负电荷的离子，其与三价钴离子形成一个配位键。维生素B12在体内是与蛋白相结合而存在的，所以在检测血浆等生物样本B12测。目前，临床上对生物样本中的微量维生素B12的检测方法有放射免疫分析B12具有多种形式，RB12发明内容B12B12转变为稳定态进行检测，提高了检测稳定性，并且所用处理剂均为安全性高的试剂，具有可操作性强的优点。一种维生素B12检测的样本前处理方法，包括以下步骤：B12由结合蛋白上释放出；所述络合剂为具有氰根离子的络合物，所1010～1045B12B12CN-络和的结构为稳定利用其中的氰根离子与维生素B121所示。但是，氰化钠和氰化钾在水溶液中完全电离得到剧毒的氰根离子，氰根离子和氰化钾作为前处理液大量使用，其操作性和可控性很差。B12B12完全反应，需保证溶液中的氰根离子达到一定的B12反应，B12完全结合，形成稳定的氰钴胺素供测定，从而确保检测结果的可靠性。而该类具有氰根离子的络合物，虽然含有氰根离子，但其很难解离，因此，该类络合物毒性很低，不属于国家管制类物质。购买，运输，储存和使用都较为1010～1045达到充分处理样本的目的，又不至于产生较大毒性，具有较好的实际应用前景。在其中一个实施例中，所述络合物的加入量为每毫升待测样本溶液加入0.5mg～5mg1.5mg-5mgB12，具有较好的前处理效果。在其中一个实施例中，所述络合物包括：六氰合钴酸盐，六氰合铁酸盐，六氰合铬酸盐，四氰合镍酸盐，四氰合铜酸盐，氰合金酸盐，氰合锌酸盐，氰合汞盐，氰合铅酸盐，或氰合锰酸盐。酸盐和II酸盐。上述络合物均可解离出微量氰根离子，从而使微量的氰根离子与维生素B12的三价钴离子结合，并且又非剧毒物质，具有较好的应用前景。所述络合物优选六氰合钴酸盐或六氰合铁酸盐，具有更佳的应用前景。特别K3Co(CN)6B12K3Co(CN)6可解离出微量氰根B12B12中的三价钴具有较好的一致性。由于金属离子容易与蛋白结合，从而改变其活性，因此，如络合物中引入了新的金属离子，可能在其中一个实施例中，所述待测样本为待测血清样本。血清样本的维生素B12pg/mL好的前处理效果。(DTT)B12B12的方法可采用常规处理手段，但是采用上述条件具有较好的释放效果。20℃～50℃8分钟～3037℃10min-15min。可钴胺素，又不影响维生素B12的稳定性。B12检测方法，采用上述的样本前处理方法。B12B12优点，并且无需使用剧毒的氰化物，具有非常好的应用前景。在其中一个实施例中，采用上述的样本前处理方法后，以化学发光免疫分析法测定待测样本中氰钴胺素的含量。本发明还公开了一种具有氰根离子的络合物在作为维生素B12检测前处理β1010～1045B12的前处理剂，既能够满足样本处理要求，达到充分处理样本的目的，又非剧毒物质，具有安全性好，操作性强的优点。在其中一个实施例中，所述络合物为六氰合钴酸盐，六氰合铁酸盐，六氰合铬酸盐，四氰合镍酸盐，四氰合铜酸盐，氰合金酸盐，氰合锌酸盐，氰合汞盐，氰合铅酸盐，或氰合锰酸盐。所述络合物优选六氰合钴酸盐或六氰合铁酸盐，具有更佳的应用前景。钴酸盐包括六氰合钴酸钾，六氰合钴酸钠等。例如，在K3Co(CN)6中具有三价K3Co(CN)6可解离出微量氰根离子微B12的三价钴离子结合，并且，该六氰合钴酸盐所具有B12中的三价钴具有较好的一致性，不引入其它金属离子，提高了检测的稳定性和准确性。本发明还公开了一种维生素B12检测试剂盒，包括以下组分：β1010～1045；磁性微粒体系：结合了内因子特异性结合物或者内因子的磁性微粒；标记物体系：标记了内因子特异性结合物或者内因子的示踪标记物；B12。。B12B12B12的检测。可以理解的，上述前处理剂中，蛋白释放剂为能够使待测样本中的维生素B12由结合蛋白上释放出的物质，如强碱，或强碱和二硫苏糖醇等。上述蛋白释放剂和络合剂可以根据其具体性质和存放要求，对各试剂单独包装或合并包装。B12的磁性微粒既可以是将维生素B12B12中使用的配合相应底物可以发光的标记物，如碱性磷酸酶或过氧化物酶等。B12氰化钠进行样本的预处理，因此，本试剂盒中的前处理剂也可以与其他维生素B12检测试剂盒中的磁微粒体系和酶标记体液组合，得到本申请的维生素B12B12电化学发光法粒体系和标记物体系，或者BeckmanCoulterB12光法与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：B12B12至于产生较大毒性的目的。B12测样本中不同形式的维生素B12稳定的优点，并且无需使用剧毒的氰化物，具有非常好的应用前景。B12B12完全结合，形成稳定的氰钴胺素供测定，具有安全B12的检测。具有安全性高，操作方便的优点。附图说明1B12稳定的氰钴胺素示意图；21K3Co(CN)6B12定的氰钴胺素示意图；31KCNK3Co(CN)641检测方法与Roche方法对比测试结果；51检测方法线性回收测试结果；62K3Co(CN)6K3Fe(CN)672K3Co(CN)6K4Fe(CN)682K3Fe(CN)6K3Co(CN)692K4Fe(CN)6K3Co(CN)6具体实施方式为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。实施例1一种维生素B12检测的样本前处理方法，包括以下步骤：50μlB1250μl，该前处理剂为氢氧0.5mol/L和K3Co(CN)61.5g/L的水溶液1.5mgDTT1.028g/L37℃下反应12.5min，使其中的维生素B12由结合蛋白上释放出，并与K3Co(CN)6在溶液中解离出的微量氰根离子结合，形成稳定的氰钴胺素，供测2所示；K3Co(CN)6β1042。B12例中，采用以下试剂盒进行检测。一种维生素B12检测试剂盒，包括以下组分：500mmol/LNaOHK3Co(CN)611.028g/LDTT柠檬酸钠缓冲液的预处2。B12B12。3mg/L的猪内因子碱性磷酸酶标记物的磷酸缓冲液。B12作如下：12混合，37℃12.5分钟。B12与猪内因子碱性磷酸酶标记物的复合物结合。B12的超顺磁性微B12B12，形成维生素B12-猪内因子碱性磷酸酶标记物和磁性微粒维生素B12-猪内因子碱性磷酸酶标记物的混合物。磁场吸附磁性微粒，洗去不含磁性微粒部分。

旋金刚烷)-4甲氧基-4-(

氧酰苯基-1,2-二氧环乙烷，AMPPD)，37℃12B12-猪内因子碱成正比例关系。记录发光读数。B12曲线来计算得到。以下对上述方法进行方法学考察。KCNK3Co(CN)6进行对比测试。KCNK3Co(CN)6B12的对比测定实验。K3Co(CN)6KCNK3Co(CN)60.9g/LKCN学发光免疫分析法分别测定待测样本中氰钴胺素的含量。3B12pg/mL纵坐标的斜率通过以下公式计算得到：其中：C0指样本中维生素B12为零时的检测发光值；CS指样本中维生素B12为横坐标浓度时的检测发光值；KCNK3Co(CN)6K3Co(CN)6替代KCN使用，具有较好的前处理效果。二、本实施例的维生素B12检测方法与Roche比较。B1239Roche(罗氏VB12检测试剂型号：cobas411)进行平行检测，Roche的检测方法为电化学发光法，进行方法学的对比。4B12RocheRR20.9774RocheVB12检测试剂相比，二者的一致性较好。三、线性回收的测定。B12B125所示。B12RR2为0.9969，说明本实施检测方法得到的测定值与理论值几乎无差异，二者具有较高的一致性。四、低浓度样本测定。为了考察在低浓度样本中检测的准确性，选取2果如下表所示。表1.低浓度样本检测。样本浓度值 测定浓度测值偏差 正确度低值样本上表中浓度值是具有较高溯源等级参考血清，由迈瑞溯源测试得到。1281.72 270.124.29％ 正确度低值样本2622.41 600.643.63％上表中浓度值是具有较高溯源等级参考血清，由迈瑞溯源测试得到。从上述结果中可以看出，本方法对不同低浓度样本检测的准确度较好，其偏差均在5％以内。实施例2B121之处在于：六氰合铁酸钾六氰合亚铁酸钾5g/L的50μl(5mg的络合物3g/L50μl(即每毫升待测样本溶3mgβ1042β1035。一种维生素B12检测方法，采用本实施例的前处理方法对待测血清样本进行1以下对上述方法进行方法学考察。K3Co(CN)6，K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6进行对比测试。K3Co(CN)6，K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6B12的对比测定实验。其中，以K3Co(CN)61K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6实施例11中加入的K3Co(CN)6分别替换为5g/L的K3Fe(CN)63g/LK4Fe(CN)6测样本中氰钴胺素的含量。结果如图6和图7所示，图中横坐标为样本中维生素B12的浓度，单位为pg/mL1的公式计算得到：从图中可以看出，以K3Co(CN)6，K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6作为样本前K3Fe(CN)6K4Fe(CN)6K3Co(CN)63Fe(CN)6K4Fe(CN)6K3Co(CN)6B12Fe离子对测定结果造成了少量的影响。1B12检测方法比较。采用上述本实