遗传学第十一章 重组DNA课件

第十一章重组DNA1．基因工程的概念2．工具酶3．载体4.重组DNA；5．转基因生物本章重点一、遗传工程概述:广义遗传工程包括:

生化工程、蛋白质工程、细胞工程、染色体工程、细胞器工程、基因工程及酶工程等。狭义遗传工程是指:

基因工程(重组DNA技术)。１.概念：重组DNA(基因工程)：在分子水平上，采取工程建设方式，按照预先设计的蓝图，借助于实验室技术将某种生物的基因或基因组转移到另一生物中去，使后者定向获得新遗传性状的一门技术。重组DNA2.重组DNA的发展：1971年史密斯（SmithH.O.）等人从细菌中分离出的一种限制性酶，酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。1972年伯格（BergP.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和λ噬菌体DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来得到新的DNA分子。完成了世界上第一个体外重组DNA实验。1973年科恩（CohenS.）等进一步将酶切DNA分子与质粒DNA连接起来，并将重组质粒转入E.cloi细胞中。1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在细菌中生产人的胰岛素投放市场。1996年，威尔穆特研究小组克隆羊“多莉”诞生（利用6岁成年母羊乳腺细胞）。1997年，威尔穆特小组报道用胎儿细胞为核供体，获得了表达治疗人血友病的凝血因子IX转基因克隆羊“波莉”1998年，美国夏威夷大学用一只实验鼠的细胞克隆了3代共50只实验鼠。2000年，美国用无性繁殖技术克隆猴子“泰特拉”，意味克隆人体已无技术障碍。2001年，美国宣布首次克隆成功处于早期阶段的人体胚胎。2002年，12月法国研究者宣布克隆出第一个女婴，但一直未获得证实。2001年种植面积>100万公顷的转基因作物：大豆（3330万hm2，占全世界转基因作物的63%，均为抗除草剂大豆）玉米（980万hm2，占19%）棉花（680万hm2，占13%）油菜（270万hm2，占5%）；水稻、小麦、花生、向日葵、亚麻、甘蓝、马铃薯、番茄、烟草、南瓜和木瓜等50多种。转基因棉花已经大规模商品化生产。

转基因棉花、大豆、马铃薯、烟草、玉米、花生、菠菜、甜椒、小麦等进行了田间试验，2004年我国的转基因农作物和林木已达27种。中国转基因植物面积3．重组DNA第一节工具酶核酸酶：切割DNA分子中，两个相邻核苷酸之间的磷酸二脂键,使之水解成多核苷酸片段。核糖核酸酶(RNase)：专一水解断裂RNA分子的两个相邻核苷酸之间的磷酸二脂键。脱氧核糖核酸酶(DNase)：专一水解断裂DNA分子的两个相邻核苷酸之间的磷酸二脂键。作用底物切割方式外切酶：从核苷酸的末端开始，逐个消化降解多核苷酸。内切酶：从核苷酸分子内部切割磷酸二脂键，而生成DNA片段。其它酶类DNA聚合酶：RNA聚合酶：反转录酶限制性内切酶(restrictionenzyme)：从核苷酸分子内部切割磷酸二脂键，而生成DNA片段。如：EcoRI、HindIII

首先，细菌细胞中发现限制-修饰系统（R-M）：

1）限制：降解外源DNA,防御异源遗传信息进入的手段(限制性内切酶)。2）修饰：修饰外源DNA片段后,保留在新细胞中(甲基化酶)。一、限制性内切核酸酶限制性内切酶酶切方式：以交错方式切断DNA双链，产生二个相同单链粘性末端。重组过程：两种片段在适宜条件下，可经磷酸二脂链，连接成重组DNA分子。5’----GAATTC---3’3’----CTTAAG----5’5’----CTGCAG----3’3’----GACGTC----5’-5’

---GAATTC----3’----CTTAAG---5’EcoRIPstI-5’

---CTGCAG----3’----GACGTC---5’粘性末端平端切割5’----AGCT---3’3’----TCGA----5’AluI5’----AGCT---3’3’----TCGA----5’5’----GGATCC---3’3’----CCTAGG----5’5’----CCGG----3’3’----GGCC----5’-5’

---GGATCC----3’----CCTAGG---5’BamHIHpaⅡ5’----GATC---3’3’----CTAG----5’Sau3AI5’----GATC---3’3’----CTAG----5’MspI同切酶BamHI、Sau3AI、MboI、NdeⅡ一组同尾酶限制性内切酶的命名：根据其来自的生物分类学上的属名、种名和菌株名来命名。

酶名称的第一个字母是属名的第一个字母，大写，斜体。第二、第三个字母是种名的前两个字母，小写，斜体。第四个字母是菌株名的前两个字母，大写或小写，正体。最后，罗马数字，表示分离几种酶的编号，I、Ⅲ①.EcoR

I来自大肠杆菌（Escherichiacoli）；②.Hind

Ⅲ来自嗜血杆菌（Haemophilus

influenzae）。3.限制性核酸内切酶的命名二、连接DNA片断的酶第1种：连接粘端的连接酶

（图A）

第2种：连接平端DNA的连接酶。

T4DNA连接酶（图B）

第3种：先加人工接头，形成粘端，再由DNA连接酶连接。PCR反应三个步聚(一个循环)：变性：94~95℃使模板DNA双链变成单链；复性：50~70℃下，引物分别与互补DNA单链互补配对；延伸：在引物的引导和Taq酶作用下，72℃下合成模板DNA的互补链。PCR

聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)

PCR反应通常有25~35个循环，一般可扩增5kb左右的片段。由该技术衍生出一些新的技术，如RAPD和AFLP等技术。第二节载体载体（vector）：体外重组DNA实验，将外源DNA片段运送进宿主细胞进行扩增或表达的运载工具。也是一种DNA分子。载体必须具备的4个条件：该载体必须具备适合的单一酶切位点，且这些酶切位点不在复制原点区域内。该载体在细胞内必须能自主复制，即必须具备复制原点；载体上要有选择标记，如抗生素基因；载体上要有插入外源DNA的克隆位点或插入位点常用的载体包括三大类，即质粒、噬菌体、噬粒质粒（常用的有pBR322、pUC系列）单链丝状噬菌体噬粒（常用的大肠杆菌丝状噬菌体包括M13噬菌体f噬菌体等）人工染色体（噬菌体人工染色体PAC、细菌人工染色体BAC、酵母人工染色体YAC）如pUC18质粒具有以下特点：①.分子量小,可接受较大外源片段；②.拷贝数多,500个／细胞；③.克隆位点的酶切位点多,克隆方便；④.具有用于检测重组质粒的选择标记（α–互补的显色表型）。1、质粒λ噬菌体（温和型）：基因组全长为49kb。能接受15kb外源DNA片段作为cDNA或核DNA克隆载体。

优点：

♣不易引起生物危害，有助于“目的”基因进入细胞并增殖；

♣携带大片段外源DNA分子，占总量25%时仍不失活。2、噬菌体3、柯斯质粒(cosmid)：噬菌体DNA+部分细菌质粒DNA序列,柯斯质粒。有噬菌体cos序列、细菌质粒复制原点、抗生素抗性标记。这种质粒分子量较小，但可接受长达50kb的外源DNA片段,克隆真核生物基因。BAC载体一般可携带大于50kb的外源DNA片段。F因子改造成BAC载体，甚至可用于克隆100kb以上的DNA片段。特点：带有外源DNA的BAC载体在细胞中是单拷贝的；载体分子量很小(7.4kb)；选择标记：氯霉素抗性基因；4、细菌人工染色体(BAC)：荧光转基因烟草第三节转基因生物一、转基因植物转基因植物是基因组中含有外源基因的植物。它可通过原生质体融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程技术获得，有可能改变植物的某些遗传特性，培育高产、优质、抗病毒、抗虫、抗寒、抗旱、抗涝、抗盐碱、抗除草剂等的作物新品种。而且可用转基因植物或离体培养的细胞，来生产外源基因的表达产物，如人的生长素、胰岛素、干扰素、白介素2、表皮生长因子、乙型肝炎疫苗等基因已在转基因植物中得到表达。农杆菌介导转化法：

农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，诱导产生冠痪瘤或发状根。分别含有Ti质粒和Ri质粒，人们将目的基因插入到经过改造的T—DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。2.基因枪介导转化法：

利用基因枪，将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。

3.花粉管通道法：

在授粉后向于房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。植物转基因主要方法植物转基因主要步骤农杆菌转化法5´

CAUG

3´

mRNA

3´

GUAC

5´

AntisenseRNA反义RNA作用原理转入成熟酶antiRNA后,西红柿保存期延长至1个月转基因动物就是基因组中含有外源基因的动物。它是按照预先的设计，通过细胞融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程和基因工程技术将外源基因导入精子、卵细胞或受精卵，再以生殖工程技术，有可能育成转基因动物。通过生长素基因、多产基因、促卵素基因、高泌乳量基因、瘦肉型基因、角蛋白基因、抗寄生虫基因、抗病毒基因等基因转移，可能育成生长周期短，产仔、生蛋多和泌乳量高，生产的肉类、皮毛品质与加工性能好，并具有抗病性，已在牛、羊、猪、鸡、鱼等家养动物中取得一定成果。还可将转基因动物作为生物工厂（Biofactories）,如以转基因小鼠生产凝血因子IX、组织型血纤维溶酶原激活因子（t-PA）、白细胞介素2、α1-抗胰蛋白酶，以转基因绵羊生产人的α1-抗胰蛋白酶，以转基因山羊、奶牛生产LAt-PA，以转基因猪生产人血红蛋白等，这些基因产品具有高效、优质、廉价与相应的人体蛋白具有同样的生物活性，且多随乳汁分泌，便于分离纯化。二、转基因动物显微注射法：在显微镜下，用一根极细的玻璃针（直径1～2μm）直接将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。用这种方法生产的动物约有1/10是整合外源基因的转基因动物。体细胞核移植方法：先在体外培养的体细胞中进行基因导入,筛选获得带转基因的细胞.然后,将带转基因的体细胞移植到去掉细胞核的卵细胞中,生产重构胚胎.重构胚胎经移植到母体中,产生的仔畜百分之百是转基因动物。人类生长激素转基因鼠动物转基因主要方法转基因牛：受精卵注射法可分泌人类生长因子Ⅸ的转基因羊“Polly”。动物转基因主要步骤：自从人类耕种作物以来，我们的祖先就从未停止过对作物的遗传改良。在过去的几千年里，农作物改良的方式主要是对自然突变产生的优良基因和重组体的选择和利用，通过随机和自然的方式来积累优良基因。遗传学创立后近百年的动植物育种，则是采用人工杂交的方法，进行优良基因的重组和外源基因的导人而实现遗传改良。转基因技术与传统技术是一脉相承的，其本质都是通过获得优良基因进行遗传改良。转基因技术与传统育种技术有两点重要区别，主要在基因转移的范围和效率上，第一，传统技术一般只能在生物种内个体间实现基因转移，而转基因技术所转移的基因则不受生物体间亲缘关系的限制。第二，