多肽的基本常识

8/8多肽的基本常识

保存:ﻫ大多肽在—2０℃很稳定，特别是冷冻干燥并保存在干燥器中,在将它们暴露于空气之前，冷冻干燥多肽可以放于室温。这将使湿度影响减少,当无法冷冻干燥时,最好的方法是以小的工作样量存放。ﻫ对于含Cｙs,Met,TｒＰ的多肽，脱氧缓冲剂对其溶解必不可少,因为这种多肽可易空气氧化,在封瓶前，慢慢流过多肽的氮气或氩气也会降低氧化作用。含Glｎ或Asn溶解性:

大多肽的首选溶剂是超纯抽气水。稀乙酸或氨水分别对于碱性或酸性多肽的溶解很重要.这些方法不溶的多肽，需要DＭＦ、脲、guanｉdinｉamｃhlｏridｅ或acｅtoniｔnle来溶解，这些溶剂可能某些实验有副作用。所以我们建议设计多肽时要加注意。

残基Ａla,Cyｓ，Ile,Leu，Met，Phe和Vａl将会增加多肽的溶解难度。

您需要特殊的多肽或任何技术帮助，请随时与我们联系。我们包你完全满意，对于我们不能适当合成的顺序，我们不收费。多肽的保存和操做ﻫﻫ包装1ｍｇ或更少的多肽按净重包装，声明的小瓶重不含相关抗离子和水。例如，氨基酸分析决定的肽含量是8０％,在1ｍｇ样品中,那么瓶中毛重是1.25mｇ.ﻫ大量的多肽以毛重算。标出的重量含相关抗离子和水，例如,25mg样品中肽百分比为９0%，那么,实际肽量为25mg×90％＝２2。5ｍｇﻫ不要把肽含量和纯度搞混了。肽的纯度可能是100%，而肽含量相关带电基团(如Arg,Lｙs）的抗离子量和肽亲水性决定。这是合成肽的本身特性。冻干肽的保存ﻫ所有产品应存于冰箱，最好为－20℃肽溶液的保存ﻫ溶液肽远比冻干形式不稳定，溶液应为中性pH(pH5—7），—２0℃保存的,为避免样品的反复冻融,最好分成小样存放.多肽的重建和操作ﻫ

多数肽溶于无菌蒸溜水。初次溶解时,要注意使初始浓度比要求浓度大，如果多肽仅有限溶解性，这便允许加入其它溶解剂或缓冲盐.

如果多肽在水中的溶解性有限，有几种选择可帮助溶解：ﻫ对碱性肽用稀乙酸(含Ａrｇ，Lys，Hｉｓ)ﻫ酸性肽用稀氨水(含Asp，Glu）

对极疏水的肽用10%有机修饰物（Ａｃetonｉtnilｅ，Methaｎol)ﻫ极不溶的肽用DMＳ0或ＤMF

gｕａｎicliｎehyｄroｃｈlｏride或脲的浓溶液也很有用,与上述方法合用，超声处理也是溶解多肽的有效手段.多肽的包装

目录中所有多肽除特别说明外,纯度为９５～98%。包装为小瓶冻干粉。除特别注明外，多肽净重包装，例如,１mg瓶的β-amyｌoid1－４0精确含1mg的多肽。多肽净重由氨基酸分析得到的肽含量计算。例如，一个多肽样品毛重5ｍg,氨基酸含量８5％,多肽净重为5mg×０.85=４。25mｇ。请注意，多肽含量不是多肽纯度,与抗离子象乙酸盐和溶剂，特别是水结合量合成多肽的本身特性。多肽纯度可能达1００%,但合成品中多肽含量由氨基酸组成,硫水性，和多肽对溶剂和离子的暴露决定,特别是在纯化过程中，无论多肽如何纯,冻干粉多肽含量一般为70－8５％。剩余１５—30%由其它基本非肽成份构成.多肽应用和保存ﻫ多肽具广泛的溶解性。多肽不溶的主要问题是形成二级结构。除了最太肽外，这点都会发生，在有多重疏水残基的肽中更显著。盐会促进二级结构形成.我们建议先在无菌蒸馏水或去离子中溶解多肽.如需要增加溶解率,可用声处理。溶解仍有问题,加少量稀乙酸(1０％)或氨水，会便于溶解。ﻫ要长期保存多肽,最好冷冻干燥，冷干粉可在－20℃或更低存放几年而很少或无降解.溶液中的多肽远不稳定。多肽易受细菌降解,应用无菌纯化水溶解。

含有Met,Ｃｙs或Ty固相多肽合成Fmoc方法ﻫﻫ任何多肽链的关键连接为肽键，由一个氨基酸的氨基与另氨基酸的缩合形成。通常一个氨基酸由一个中心碳原子组成，它由四个基它基团包围：氨基、羰基、基和侧链.侧链，称为R,区别不同氨基酸的结构.某些侧链含有干扰肽键形成的功能团。因此侧链功能团的封闭很重要。ﻫ图工显示了Fmoc合成的一般流程，首先第一个Fmｏｃ氨基酸通过一个酸性接头接到不溶载体树脂上,Fｍｏc去保护通过用碱处理树脂来完成,一般是Ｐｏｐｅｒiｄine.用预先激活或原位激活连接第二个Ｆｍoc氨基酸.要求总多肽合成后，通过TFA分离来除去树脂和去保护。Fmoc分离固相多肽合成中多肽分离主要用酸解Fmoc法用弱酸，比如TＦA或TMSＢr.各种添加剂,一般为thiolcompoｕnｄ，水和酚,用来保护多肽的免分离中Carｂoｃａtiｏn的破坏。下列保护基与TＦA和ＴMSBr分离相合:（略）基于保护基团的类别，必须使用去保护剂的组合。例如,当Boc和tButyl存在时,它们的Cａｒbｏｃａtion对应物能与Trp，Tyr和Meｔ反应形成ｔbuｔyｌ产物.ＥDT是极有效的ｔ—ｂｕtｙｌｔriｆlｕoroacetａte清除剂，但它不保护Ｔrp。因此，必须加水以控制烷基化。Trp的吲哚环和Tyｒ的OH极易与Pmｃ反应.水再次表现出对此反应的抑制。Ｔrｔ和Mtr基团也有相似情形。较此适当组合清除剂将极大降低副反应。ｔBoｃ和ＣBZ多肽合成ｔＢoｃ合成法见图３ｔBoc法的分离法Ｂｏｃ使用强酸，比如HF，TＦMSA或TＦMoTf。分离加入各种添加剂，一般为thiol化合物以保护多肽免受carbｏcation破坏。ＨF分离法(如下）略TFＭSＯＴf分离ＴMSＯＴf分离SPＰS的一般连接方法适于固相多肽合成的连接反应要求酰化反应,对同源多肽最有效。ＦmocＳＰＰS连接方法ＦmoｃSPPＳ最常用的连接法是活性酯，要么原位，要预先激活.起初Ｐ-niｔｒophｅnｙl和N－hydnｘysuccinimiｄe激活酰是常用形式。甚至,有HOBt时，连接反应也很慢，此外，Ｆmｏｃ氨基酸ＯNSu、酯与succｉniｍido-carｂｏnｙl—β－ａlanine-N-Hyｄroxysｕccinididｅ酯副产物的形成相关。今天最常用的激活酯是Opfp和Odhbt。有HoBt时反应速度极快，副产物少。另一方面，使用象DCC，HＢTU,BOＰ,ＢOP-Ce，或TBTＵ活化剂时,能原位进行许多连接反应.Carboｎdｉimｉde的直接添加是最佳选择.然而,TBTU和HBＴU第二个出现，接着ＢoP，最后是ＢoP-CＥ。再者，酯连接发现BoP／HｏBｔ〉Carbｏｄiimｉdo/HoBt＞Carｂodiiｍｉｄo/ODHｂT>Ｃaｒbodiiｍｉdｅ／Opｆp.最近以来，ＨOAt和其对应Ｕroｎium盐同类物HATU的发展，发现此ＨoＢt和HＢＴU具更强催化活性，结果是增加连接产出,缩短连接时间，消旋降低。故此，更适合阻位氨基酸的连接,使得难合成肽的合成更成功。ｔBocSPＰＳ的普通连接法Cａrbｏdiimｉdes，主要是DCC是使用多年的连接试剂,主要的问题是激活和酰化过程中dicｙcloｈexylurｅa的沉淀。并且伴有许多副反应,已有几种产生可溶脲的Carbodiiｍide，例如DIC，t-butylｍetｈyl—和t—ｔaｔｙｌlethyl－ｃａrbodiｉｍidｅ，但是这些试剂未解决副反应的问题。结果生产出了新的激活剂。首先是ＢOP，随后是PyBrｏp,ＰyＢOP,HBTU，TＢＴU和HＡＴＵ。所有前述试剂都要活性碱基。所有前面讨论的DCC及其衍生物都通过对称酐的形成起作.通常，对称酐反应性极强已广泛用于ＳPＳＳ，特别t－Boc合成中,对称酐整合入Fｍoc氨基酸有一些困难,例如，从N－(3—diｍethｙlaｍｉｎoｐropyl）—N？/FOＮT〉—ｅthyｌ-carｂｏdiｉmides—HＧ制备的对称酐，由于Ｚ—ａlkory—5(4Ｈ）—ｏｘayoｌｎe中间体的形成，在Ｃarbodｉimidｉe和tｅrtianyａｍines存在时重排，还有,不是所有的Fmoc对称酐都溶于ＤＣM，或者无论所有试剂如何都不溶。对称酐的另一种改变是混合酐,Carboxglic—Carbｏｎate或Ｃaｒboxｇlｉc-ｐｈｏsｐhｉｎｉc混合酐，典型的情况且是,由活性ｉsｏｂutyl—或isｏpｒｏｐｙl—cｈorｏfｏrmatｅ制备这些，用Nox被阻氨基酸代替phｏsphiｎiccｈｌｏｒｉｄe.通常反应迅速及少或无有副反应.混合酐,N－carbｏxｙ酐（NCAS），也叫,Leuch酐，已广泛用于多聚氨基酸制备，这类化合物联合Ｎox保护和活化炭基，一旦和另一个氨基酸或肽残基反应，释放CO2做为副产物。用光气处理α氨基酸很容易得到ＮCA衍生物，在严格调控条件下，ＮCＡ衍生物常结晶析出,便可使用。这些条件要求严格控制合成中的PH，在ＰＨ值低于１０时，NCA和肽或氨基酸残基反应产物，肽—Carbamate易失去CＯ2形成自由α-氨基端,发生聚合。pH10．5时，ＮCA便水解隆解。所以反应在ＰＨ10.2条件下进行。别的条件要求是反应在０℃液相合成ﻫ基于将单个Ｎ—α保护氨基酸反复加到生长的氨基成份上,合成一步步地进行,通常从合成链的Ｃ端氨基酸开始，接着的单个氨基酸的连接通过用ＤＣC,混合炭酐,或N—caｒboｘy酐方法实现。Carboｄiiｍide方法包括用DＣC做连接剂连接N－和Ｃ—保护氨基酸。重要的是,这种连接试剂促接N保护氨基酸自己炭基和Ｃ保护氨基酸自由氨基间的缩水，形成肽链，同时产出N，N？／FONT＞—dyaylcoherｃyｌureａ副产物。然而，此方法因其导致消旋的副反应,或在强碱存在时形成5（4H）-oxaylｏnes和Ｎ—acylｕreａ而受到影响.庆幸地是，这些副反应能最小化,如果还不能完全消除。方法是加入象ＨｏSu或ＨｏBT这样的连接催化剂，此外，此方法也可用于合成N保护氨基酸的活性酯衍生物。依次产生的活性酯将自发与任何别的C保护氨基酸或肽反应形成新的肽。ﻫ当从副产品,diａｙdoｈexyｌurｅa分离活性酯有困难时,可用混合Carboｎiｃ酐方法，此方法由两步组成，第一步是在有teｒtｉarｙ碱的有机溶剂中用适当的酰基氯激活Nx保护氨基酸的炭基，第二步是让肽或氨基酸的自由氨基与Carbｏnic酐反应.Carboｎic酐通常加到自由氨基的14倍.

虽然此方法在低温时高效高产，产品纯，但也有其缺点,例如,由羰基的强激活酐衍生物有消旋倾向。然而此问题在使用Nｘ-α—Urｅｔhane保护基(Cｂ2,或tBoc）时便不会发生。进一步：由于高反应性，混合Ｃarboｎiｃ酐倾向5(4Ｈ）－ｏｘagｏｌomｅs，Urｅrbaｎesdｉacyimide，酯的形成，并易失调.ﻫ促进这些副反应的条件是高温，延长激活时间（即，混合酐形成后，加到alkyｌchlｏrocarbonａte和aｍinｅ成份的时间，ａmine组成的空间占位，平共处和混合酐的不完整形成。幸运的是，大多这些副反应，除形成哑唑酮和脲烷外,可通过低温进行反应(～－1５℃)，大为减少,并且缩短活化时间（~1－2分钟)。为了使哑唑酮和尿烷形成最少，要实行如下措施：1)必要性须用无水有机溶剂,乙酸，四氢喃，t-butaｎd，或acetonitrｉle;2)应使用tｅrtiary碱和N—meｔhｇlmｏrpholiｎe；3)必须用Cｂ2或tBoｃN-α保护氨基酸。ﻫ虽然用iｓoｂuｔｙl-和etｈylcｈlorocaｒbonatｅ常用来形成羰酐，但确有别的连接试剂，例如,EEQD和IIＱD用来与ＣａrｂoｘaＰ成份反应形成ｅrｈyl－或ｉsobutylcarｂonaｔe衍生物.不同于传统酐程序，ＥEQD和ＩIQＤ不要求碱,也不要求低温，通常要求一种有机溶剂(有许多也用）中0。1－0．４MＨPＬC分析和纯化

分析ＨＰLC使用柱子和泵系统，可以经受传递高压，这样可以用极细的微粒(3-１0μｍ）做填料.由此多肽要在几分钟内高度被分析。ﻫHPLＣ分两类:离子交换和反相。离子交换HPLＣ依靠多肽和固相间的直接电荷相互作用.柱子在一定PH范围带有特定电荷衍变成一种离子体,而多肽或多肽混合物,由其氨基酸组成表现出相反电荷。分离是一种电荷相互作用,通过可变ＰH,离子强度，或两者洗脱出多肽，通常，先用低离子强度的溶液，以后逐渐加强或一步一步加强，直到多肽火柱中洗脱出。离子交换分离的一个例子使用强阳离子交换柱.如sulfoethylasｐaｒｔiｍide通过酸性PH中带正电来分离。ﻫ反相HPLC条件与正常层析正相反。多肽通过疏水作用连到柱上,用降低离子强度洗脱，如增加洗脱剂的疏水性。通常柱子由共价吸附到硅上的碳氢烷链构成，这种链长度为G4—G8碳原子.由于洗脱是一种疏水作用。长链柱比短链对小的，高带电肽好。另一方面大的疏水肽用短链柱洗脱好.然而，总体实践中,这两类柱互变无多少显著差别，别类载体由碳水化合物构成,比如苯基。

典型的操作常由两绶冲剂组成,0。1%TFA—H2o和８０%aceｔoｎｉtrｉle0.1％TFA-－H2o稀ａｃetonitriｌｅ。用线型梯变以每分钟0。5％到１．０％改变的速度混合。常见分析和纯化用柱为