细胞融合与单抗技术课件

细胞融合与单克隆抗体基础知识细胞融合单克隆抗体技术人源性单克隆抗体的制备（一）、免疫：机体识别和排斥异己物质的机能。一、基础知识“非已”的异种或异体物质（抗原）胚胎时期：淋巴细胞接触过的物质-------“自身”物质淋巴细胞未接触过的物质----“异己”物质免疫原性免疫反应性半抗原（不完全抗原）：无免疫原性，仅有免疫反应性的抗原完全抗原决定免疫原性的因素:异物性:指抗原与自身物质之间免疫原性的差异.一定的理化性状大分子物质化学组成与结构抗原决定簇抗原决定簇抗原决定簇:存在于抗原分子表面的特殊化学基团,是淋巴细胞识别抗原的标志.基团免疫防御：指机体防御病原生物感染的功能。

免疫稳定：指机体清除体内衰老、死亡或受损 伤的细胞，以维护自身生理平衡与稳 定的功能。免疫监视：指机体防止或清除体内组织细胞在新 陈代谢过程中可能发生的突变细胞，以 防止发生肿瘤功能：非特异性免疫（先天性免疫或天然防御机能)（按来源不同分）类型：组成屏障结构吞噬细胞的吞噬作用正常体液中的抗微生物物质(如补体、溶酶体）特异性免疫（获得性免疫）（按来源不同分）是机体在生活过程中接触抗原物质或被动获得抗体等免疫物质后所产生的特异性的免疫。类型：特异性免疫是在非特异性免疫基础上形成的；特异性免疫的形成增强了非特异性免疫相互关系

出现较慢，专一性强，强度大出现快，作用范围广，强度较弱特点后天获得先天具备来源特异性免疫非特异性免疫免疫类型4、发展史：萌芽期兴盛期跃进期人工自动免疫人工被动免疫免疫器官：骨髓、胸腺、外周

免疫器官免疫细胞:淋巴细胞、吞噬细胞免疫分子:抗体和淋巴因子6、免疫系统的组成：T细胞（中）和B细胞抗体产生的一般规律：初次应答再次应答 潜伏期：2-3周。此期不能在血液中检测出抗体。 对数期：抗体水平呈对数增加。 平台期：抗体水平相对稳定 下降期：由于抗体被降解或与抗原结合而被清除，

体内抗体水平逐渐下降。①潜伏期短，一般为2-3天②抗体产生快，血中浓度高，维持时间长。强化免疫:间隔一定时间多次接种.二、细胞融合（一）定义异核体（异型核合胞体）：一个细胞含有两个不同的细胞核，这种细胞叫做异核体。融合剂甲细胞乙细胞……指在离体条件下用人工方法将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术．促融因素及其诱导融合作用问题：如何筛选目的细胞？促融因素及其诱导融合作用电场融合机制：膜蛋白与脂质分子的重新排布。促融因素：病毒PEG概念：在一定条件下，通过电脉冲作用使细胞融合的过程称电场诱导融合作用。原理：电击前的两细胞电击穿细胞膜局部小区膜融合细胞收缩变形，融合小区被拉成丝状细胞进一步融合融合后的双核体（二）杂种细胞的筛选原理及筛选系统同型双核细胞同型多核细胞未融合的亲本细胞异型多核细胞：异型双核细胞：目的细胞筛选原理：将融合混合物接种于选择性培养基上， 终止同型多核、异型多核、及未融合的 亲本细胞的繁殖，而仅允许异型双核细 胞繁殖。 HAT选择培养基：含H（次黄嘌呤）、A（氨基喋呤）、

T(胸腺嘧啶核苷）的一种选择培养基。筛选系统和方法：HAT选择培养基1、全合成途径：利用糖和氨基酸等外源营养经体内代谢 合成DNA的途径称全合成途径正常动物细胞DNA合成途径：糖和氨基酸核苷酸A（二氢还原酶的抑制剂）DNA结果：全合成途径被终止。HGPRT+：具次黄嘌呤磷酸核糖转移酶，缺失则不能

进行嘌呤的合成．TK+：胸腺嘧啶核苷激酶，缺失则不能进行嘧啶的合

成．DNA核苷酸及其前体TdTMPTKHGPRTHHMP

核苷酸2、补救合成途径：细胞从培养基或自身代谢产物中 吸收游离嘌呤和嘧啶合成DNA的 途径称补救合成途径死亡存活死亡亲本2（HGPRT+,TK+）亲本1（HGPRT-/TK-）HATPEG融合体HATHAT（长寿命的瘤细胞）（短命的B细胞）三、单克隆抗体技术单克隆抗体:是由单一B细胞和杂交瘤细胞融合后的克隆株细胞产生的,只针对一种抗原决定簇的单一抗体.（一）、定义（二）、原理１．细胞培养材料的准备:２．免疫动物３．亲本细胞的准备４．细胞融合５．融合细胞的筛选与克隆

单克隆抗体的大量制备（三）流程有限稀释法接种瘤细胞，２０％胎牛血清，常规培养．优质血清能支持接种量≤２０个细胞／孔的细胞生长．防止污染、筛选血清．动物选择：选择与瘤细胞供体同品系的动物抗原颗粒性抗原：免疫原性强，免疫时 不加佐剂可溶性抗原：免疫原性弱，免疫时 需加佐剂提高免疫效果半抗原：无免疫原性，需与载体 结合后，才能免疫．凡能固定抗原，并使之缓慢释放的惰 性、无毒的物质．（膜体，珠体）免疫途径：腹腔、皮下淋巴样器官、静脉免疫佐剂:是能增强抗原免疫原性,或改变免疫 反应类型的物质(如:完全弗氏佐剂)骨髓瘤细胞的选择:本身不分泌任何抗体（筛选缺陷细胞株）HGPRT-或TK-8-Az（杂氮鸟嘌呤）6-TG（巯基嘌呤）筛选Br-脱氧嘧啶核苷筛选脾细胞分离：放血处死动物取脾脏，注射无血清培养液，挤压释放淋巴细胞富集特异性B细胞小鼠骨髓瘤细胞：冻存瘤细胞的复苏．骨髓瘤细胞：脾细胞＝１－２：１０步骤：离心沉淀细胞缓慢加入PEG1ml，不断转动试管１５ml无血清培养液（慢）20%血清常规过夜培养HAT筛选洗涤96孔板筛选杂交瘤细胞培养约3d，未融合细胞开始死亡（胞浆出现颗粒细胞开始破裂），每3d换液一次。第10-14d，以HT培养液逐渐代替HAT，进行半量换液。当细胞集落长到1/5-1/3孔时，收集上清夜进行特异性抗体检测。HAT培养液（每孔100ul）对照：未融合的骨髓瘤细胞筛选杂交瘤的方法：第二抗体法一抗：与目的抗原专一性结合，多为IgG型。二抗：抗IgG抗体IgG特异位点标记酶解决方法：融合细胞进行克隆：有限稀释法，软琼脂法杂交瘤染色体鉴定多次重复筛选。问题：每个融合培养孔可能有针对不同抗原决定簇的多个克隆存在。杂交瘤不稳定。结果：连续3次特异性抗体检测阳性率为100%。体外培养：对数生长期杂交瘤细胞悬浮 于５％血清培养基中，常规培 养２ －３d,补充２．５％血清 培养基， 继续培养２d,离心收 集上清．体内培养：腹腔注射对数生长期杂交瘤细胞，诱生腹水，１－２周后取腹水．（四）单克隆抗体的大量制备：四、人源性单克隆抗体的制备治疗用抗体发展的三个阶段单克隆抗体基因工程抗体多克隆抗血清鼠源性引起免疫排斥人源性单抗制备的困难1、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是（）A.经过免疫的B淋巴细胞B.没经过免疫的T淋巴细胞

C.经过免疫的T淋巴细胞D.没经过免疫的Ｂ淋巴细胞A巩固练习2.单克隆抗体制备过程中培育的杂交细胞是------（）A.由小鼠能产生抗体的B淋巴细胞与肝细胞融合B.由小鼠一个B淋巴细胞诱导融合而成C.由小鼠一个B淋巴细胞与肌瘤细胞诱导融合而成D.由小鼠一个B淋巴细胞与骨髓瘤细胞诱导融合而成D右图是某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌抗体的实验方案。请据图回答：

(1)该方案能达到预期效果吗？____，原因是___________________________。

(2)图中②为__过程，常用__诱导剂。该细胞继承了_______的遗传性质。既能