SOD检测波长的选择及含量测定2022优秀文档

实验七SOD检测波长的选择及含量测定一、超氧化物歧化酶的根本特性

及生理功能1、超氧化物歧化酶的组成超氧化物歧化酶〔SuperoxideDismutase,SOD〕是一种能催化超氧阴离子自在基发生歧化反响的金属酶，按金属辅基不同分为三类：Cu,Zn-SODMn-SODFe-SOD自在基：是一类非常活泼的化学物质，人体正常的新陈代谢就会产生自在基、是人体活动所需求的，但在某些特殊的情况下，体内会产生过量的自在基。它可聚集体在人体各组织器官上，导致各种慢性病与老化，故说它是[万病之源]，是人体安康的大敌。2、超氧化物歧化酶的生理功能〔1〕延缓由于自在基损害引起的衰老景象〔2〕治疗由自在基损伤而诱发的疾病〔3〕消除肌肉疲劳〔4〕提高人体的抵抗力蛋白质含量测定方法定氮法紫外分光光度法双缩尿法〔Biuret法〕Folin－酚试剂法〔Lowry法〕考马斯亮蓝法〔Bradford法〕其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的规范蛋白质。值得留意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何方式的蛋白质，由于一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有能够得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺陷。在选择方法时应思索的几点要素①实验对测定所要求的灵敏度和准确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要破费的时间。考马斯亮蓝法〔Bradford法〕，由于其突出的优点，正得到越来越广泛的运用。一、紫外分光光度法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收顶峰在280nm处，其吸光度与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进展蛋白质含量的测定。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用规范曲线法测定蛋白质含量时，对那些与规范蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差别大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与规范蛋白质氨基酸组成类似的蛋白质。假设样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。

二、双缩脲法〔Biuret法〕双缩脲〔NH3CONHCONH3〕是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4构成紫色络合物，称为双缩脲反响。凡具有两个酰胺基〔-CONH2〕或两个直接衔接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反响。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定波长为540nm，测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺陷是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需求快速，但并不需求非常准确的蛋白质测定。三、Folin—酚试剂法〔Lowry法〕此法的显色原理与双缩脲方法是一样的，只是参与了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以添加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反响产生深兰色的缘由是：碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。此复合物将Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐复原，产生深兰色〔钼兰和钨兰的混合物〕。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。

这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺陷是费时间较长，要准确控制操作时间，规范曲线也不是严厉的直线方式，且专注性较差，干扰物质较多。

此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20-250mg。四、考马斯亮兰法〔Bradford法〕1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法〔Bradford法〕，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超越其他几种方法的突出优点，因此正在得到广泛的运用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置〔lmax〕，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研讨以为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸〔特别是精氨酸〕和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。

SOD检测波长的选择及含量测定实验目的掌握SOD检测波长的选择方法学习考马斯亮兰法测定蛋白质含量的原理。掌握考马斯亮兰法测定蛋白质含量的实验技术。假设样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。〔2〕治疗由自在基损伤而诱发的疾病主要的缺陷是灵敏度差。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺陷是费时间较长，要准确控制操作时间，规范曲线也不是严厉的直线方式，且专注性较差，干扰物质较多。故该法适于用测定与规范蛋白质氨基酸组成类似的蛋白质。实验七SOD检测波长的选择及含量测定因此双缩脲法常用于需求快速，但并不需求非常准确的蛋白质测定。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用规范曲线法测定蛋白质含量时，对那些与规范蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差别大的蛋白质，有一定的误差。准确称取SOD粉末10mg，用0.①实验对测定所要求的灵敏度和准确度；15mol/LNaCl溶液为空白分别进展全波长扫描，并记录最大吸收波长。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。此复合物将Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐复原，产生深兰色〔钼兰和钨兰的混合物〕。取6支试管，按下表操作。超氧化物歧化酶〔SuperoxideDismutase,SOD〕是一种能催化超氧阴离子自在基发生歧化反响的金属酶，按金属辅基不同分为三类：15mol/LNaCl溶液，混匀后，参与5ml考马斯亮蓝试本实验采用考马斯亮蓝G-250法测定SOD浓度。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色方式，红色和蓝色，它和蛋白质经过范德华力〔Vanderwals′bond〕结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律〔Beer′slaw〕。此染料与蛋白质结合后颜色由红色方式转变成蓝色方式，最大光吸收由465nm变成595nm，经过测定595nm处光吸收的添加量可知与其结合蛋白质的量。实验原理仪器：电子天平、紫外分光光度计、小烧杯、容量瓶、玻璃比色皿、洗瓶、试管、滤纸、擦镜纸试剂：超氧化物岐化酶、考马斯亮蓝G-250、磷酸、95％乙醇、NaCl考马斯亮蓝试剂：准确称取考马斯亮蓝G-250100mg溶于50ml95％乙醇，参与100ml85％磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01％〔W/V〕考马斯亮蓝G-250，4.7％〔W/V〕乙醇，8.5％〔W/V〕磷酸。仪器与试剂1.SOD检测波长确实定准确称取SOD粉末10mg，用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml蛋白溶液，作为规范贮藏液Ⅰ。从上述贮藏液Ⅰ中汲取两份，每份0.4ml，分别放置在试管中，其中一份参与0.15mol/LNaCl溶液5ml，摇匀后备用；另一份中先参与0.15mol/LNaCl溶液0.6ml，再参与5ml考马斯亮兰试剂，1h内以0.15mol/LNaCl溶液为空白分别进展全波长扫描，并记录最大吸收波长。实验步骤2.SOD规范曲线的制造取已配制好的规范贮藏液Ⅰ备用。取6支试管，按下表操作。试管编号0123451mg/mlSOD溶液/ml00.20.30.40.50.60.15mol/LNaCl/ml1.00.80.70.60.50.4考马斯亮兰试剂/ml5ml摇匀，1h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色SOD规范曲线15mol/LNaCl配制成1mg/ml蛋白溶液，作为规范贮藏液Ⅰ。掌握SOD检测波长的选择方法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用规范曲线法测定蛋白质含量时，对那些与规范蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差别大的蛋白质，有一定的误差。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色方式，红色和蓝色，它和蛋白质经过范德华力〔Vanderwals′bond〕结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律〔Beer′slaw〕。仪器：电子天平、紫外分光光度计、小烧杯、容量瓶、在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4构成紫色络合物，称为双缩脲反响。1mg/mlSOD溶液/ml从上述贮藏液Ⅰ中汲取两份，每份0.实验七SOD检测波长的选择及含量测定此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。1、超氧化物歧化酶的组成因此双缩脲法常用于需求快速，但并不需求非常准确的蛋白质测定。③溶液中存在的干扰物质；〔2〕治疗由自在基损伤而诱发的疾病3.样品测定精细汲取1mg/ml的SOD溶液0.35