中国食品药品检定研究院 药品微生物控制问题与对策

当前药品微生物检验控制面临的问题与对策马仕洪中国食品药品检定研究院2019年11月8日，广州•

深化监管体制改革背景下的药品微生物实验室规划与发展•

《中国药典》药品微生物控制体系的进展与挑战•

益

菌相关药物的质量分析与控制药品微生物风险识别与控制•

微生物计数数据的可变性与检验结果的复测复验•

非无菌药品的控制菌检查与不可接受微生物的评估•

中国药典非

菌药品微生物限度检查的操作要点•

非无菌材料和制剂检验过程控制及微生物实验室数据完整性•

国际注射剂无菌保障与微生物过程控制•

药品微生物检验控制

问题与对策问题与对策药品微生物控制体系进展与挑战胡昌勤杜婧问题与对策:无菌药品生产环节中微生物的控制要素含益生菌成分药品质量分析现状和相关标准探讨药品微生物检测技术重点实验室的定位与申报王知坚绳金房钟光德蒋箭平吴金辉蒋波机构改革形势下的微生物实验室发展药品微生物检测技术重点实验室申报《中国药典》2020版微生物通则增修订分子生物学及生物指示剂评价能力建设微生物瞬时检测及ClO2空间除菌技术进展GMP检查中的微生物问题分析无菌药品生中微生物控制的GMP合

性分析与评价新型微

物检测方法的应用推进简介ClO2新型气体消毒技术应用进展《中国药典》分子生物学体设及微生物鉴定相关进展灭菌法（修订）课题完成情况

报凝胶剂微生物应急事

的应对体会小儿咳喘灵颗粒检出鲍曼不动杆菌的风险研判中检院十年药品微生物复验数据分析抑菌剂合理性评价工作回顾李珏张亚杰顾珉不可接受微生物风险评估及应急事件应对检验数据挖掘杨美琴戴翚检验经验交流无菌检查用几种特殊溶剂的有效性考中检院生物指示剂质量评价能力建设解慧王似锦1、药品微生物检验控制的内涵2、当前药品微生物标准的认识与定位3、定量风险与微生物计数数据的可变性4、定性风险与不可接受微生物的评估5、药品微生物实验室能力建设要点会议全面总结了我国自1973年8月13日国务院颁发[121]号文提出加强药品微生物检验40年来所取得的经验和成就，充分讨论了新时期我国药品微

物检验的标准提升、技术进展和实验室建设管理经验。此次研讨会恰逢新版GMP和药典方案相继出台，我国药品微生物检验面临从传统的

产品检查型向溯源分析调查型转变，会议承前启后、继往开来，必将推动我国药检系统微生物检测能力提升、适应新的监管要求，是一次非常重要而及时的会议。（化药所供稿/2013年12月2日）为什么没有提前发现问题？微生物检验能力建设分析调查能力“终产品检验”向“过程控制”转变我们的药品为什么会这样？以药品污染微生物为线索，通过对微生物DNA、生理生化、谱图特征等深入到菌株水平的鉴别分析，借助微生物地图、污染菌株数据库、计软件等进行统计评估，快速准确识别药品污染风险；以药品污染微生物为目标，科学评估药品研发设计中的微生物控制策略，合理确定原辅料及中间品的微生物荷载水平，以及有效验证生产与使用全程环境控制、清洁、消毒、灭菌等工艺措施，达到全面控制药品微生物污染风险、切实保障用药安全的目的。——摘自《人口健康领域备选技术报送提纲》•

药品因素•

抽

检查•

环境控制•

操作影响•

破坏试验•

培养观察•

OOS调查方法验证过程控制一次性结论结果判断——摘自钟光德教授2019年10月11日课件药品微生物过程控制的内在需求-频繁发生的药品污染事件-注射剂一致性评价/再评价-中药C

辐照滥用问题-CART等创新药的无菌快速释放《生化制剂无菌

障评价标准研究》—2018年药典标准提高课题《注射剂一致性评价微生物控制与溯源调查评价研究》—“十三五”重大新药创制《消毒剂效能验证指导原则的建立研究》—2019年药典标准提高课题2、当前药品微生物标准的认识与定位1101

无菌检查法1105

非无菌产品微生物限度检查

：微生物计数法1106

非无菌产品微生物限度检查法：控制菌检查法1107

非无菌产品微生物限度标准112

菌效力检查法1421

灭菌法（重大修订）中药饮片微生物限度检查法（新增）9201

药品微生物检验替代方法验证指导原则9202

非无菌药

微生物限度检查指导原则9203

药品微生

验室质量管理指导原则9204

微生物鉴定指导原则9205

药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则9206

无菌检查用隔离系统验证指导原则9207

灭菌用生物指示剂指

则（新增）9208

生物指示剂耐受性检查法指导原则（新增）《中国药典》2020年版与国外药典USP3/JP17部分章节《中国药典》2020年版<51>Antimicrobial

Effe

iveness

Testing1121抑菌效力检查法<55>BiologicalIndicators-Resistance

Performance

Tests9208生物指示剂耐受性检查法指导原则洋葱伯克霍尔德菌群检查法<60>Test

fo

.cepacia

complex<61>

icrobiological

Examination

ofNonsterile

Products:MicrobialEnumeration

Tests1105非

菌产品微生物检查：微生物计数法<62>Microbiological

Exfor

Specified

Microorgani

sation

ofNonsterile

Products:

Tests1106非无菌产品微生物检查：控制菌检查法<1111>Microbiolog

al

Attributes

ofNonsterile

PharmaceuticalProduct1107非无菌药品微生物限度标准1101无菌检查法<71>Sterility

Tests<1035>/<1229>Biological

Indicator

for

Sterilization<1072>Disinfectants

and

Antiseptics207灭菌用生物指示剂指导原则消毒剂效能验证指导原则《中国药典》2020年版与国外药典USP3/JP17部分章节《中国药典》2020年版<1112>Aplication

of

Water

Activity

Determination

to

NonsterilePharmaceutical

Pr

ucts水活度检查法用于非无菌药品微生物评价<1113>Mical

Characterization,

Identification,

and

Strain

Typing9204药品微生物鉴定指导原则<1116>Micr

biological

Evalution

ofClea

RoomsandOther

Co

trolled

9205药品洁净实验室微生物监测和控制指导Envir

ments原则<1117>Microbiological

BestLab

ratory

Practices03药品微生物实验室质量管理指导原则<1208>Sterility

Testing-tion

of

Isolator

System9206无菌检查用隔离器系统验证指导原则<1229.1～14>1421灭菌法（重大修订）<1211>Sterilization

and

Sterility

Assurance

of

Compendial

Articles/<1223>Validationof

Alternative

Micro/icalMethods9201药品微生物检验替代方法验证指导原则9202非无菌药品微生物限度检查指导原则/JP17

5.02

Microbial

LimitTest

for

Crude

Drugs中药饮片微生物限度检查法差异原因国内

物制品无菌检查在引用WHO导则6出现的对FTM两种培养温度的规定；欧美ICH1994年接受USP/EP方法1101无菌检查法中生物制品的特殊规定我国是抗生素及注射剂生产使用大国，大量的产品验证报告表明检验条件下大肠更适合作为方法验证菌株1101无菌检查法中以大肠为验证菌株1101、1105等

CMCC菌国际主要菌种保藏机构的利益冲突，当前维护中国大量中小型制药企业利益的必要性进一步强调培养观察体系的参照

NoControlNoTest）提供履行按验证/转移过方法系统检验的直接证据1101、1106阳性对照的规定1121抑菌剂效力检查法判断规则与EP一致，但

USP/EP亦未就此协调，随着我国开

此项工作的经验积累，还实验菌株规定有差异

会进一步调整更合适的菌株2、当前药品微生物标准的认识与定位总体上，当前我国药品微生物检查在检验方法、检验程序、实验要求、标准

征方式等方面与ICH方案基本一致，由于中药的特殊性，ChP2015版的实施以及ChP2020的增修订还是存在较大挑战，未来应在中药标准方面研究完善，在与ICH方案的进一步协调一致问题上更需深入研究讨论。标准的发展有一定的过程和规律，必须兼顾历史和现实，必须符合一国的工业实际需求。2、当前药品微生物标准的认识与定位（1）、关于标准菌株•

大肠埃希菌(Escherichia

coli)〔CMCC(B)44102〕•

枯草芽孢杆菌（

Bacillus

subtilis〔CMCC(B)63501〕——ATCC

6633•

金黄

葡萄球菌(Staphyl

coccus

aureus)〔CMCC(B)26003〕——ATCC

6538P•

型副伤寒沙门菌Salmonella

paratyphi

B)〔CMCC(B)50094〕•

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)〔CMCC(B)

0104〕•

生孢梭菌(Clost

um

sporogenes)〔CMCC(B)

64941〕•

白色念珠菌

Candida

albicans)[CMCC(F)98001]•

黑曲霉（

Aspergillusniger）〔CMCC(F)

98003〕——ATCC10231Aspergillusbrasiliensis

〔Suc

sATCC

16404，IMI149007,IP1431.83,orNBRC9455

〕标准储备菌种标准菌株、储备菌株、工作菌株标准储备菌种：(1)、获得方便(2)、使用简单(3)、性能可靠——WHO

good

practices

for

pharmaceuticalmicrobiology

laboratories（WHO

TechnicalReport

Series,

No.9

1,

2011，Annex

2）2、当前药品微生物标准的认识与定位（2）、关于培养基上世纪80～90年代中检所配合药典的收载逐渐完成了干粉培养基的研制及配方确定，奠定了我国药品微生物检验用干粉培养基基础。药典微生物检查方法：经典方法、培养观察！干粉培养基实验室制备即用、预制培养基如何控制培养基质量？USP/EP/《中国药典

2010/2015年版——培养基适用性检查USP<61>/<62>:For

afreshly

preparedinoculum,growthofthemicroorganisms

comparable

tothat

previouslyobtained

with

apreviouslytested

and

approved

batch

ofmedium

occurs.

我国药品微生物实验室小而分散，数以千计的企业和基层药检所难以有效地进行参比培养基的验证、评价工作；

在监督检查中，难以有效评估企业微生物实验室对参比培养基的验证情况。24培养基质量控制：USP—之前验证过的培养基中国药典—对照培养基•中国食品药品检定

究院按国家标准物质程序研制供应•单剂量免称量

立包装专利号：ZL200920108836.8马仕洪，杨美琴，刘鹏，曹丽梅，胡昌勤.《

国药典》2010年版对照培养基的研制与应用，《中国药事》，2012（8）2、当前药品微生物标准的认识与定位•

无菌物品是指物品中不含任何活的微生物。对于任何一批灭菌物品而言，绝对无

既无法保证也无法用试验来证实。一批物品的无菌特性只能通过物品中微生物存活概率来表述，即非无菌概率（Probability

of

a

Nonsterile

Unit，简称PNSU），这也被称为无菌保证水平（Sterility

Assurance

Level，简称SAL）。最终灭菌物品的非无菌概率不得高于10

。已灭菌物品的非无菌概率可通过验证确定。——《中国药典》2020版灭菌法（1421）讨论稿2、当前药品微生物标准的认识与定位《中国药典》面临的概念难题！SterileSteradjnSt

rilization

n生物去污？灭菌？Biodecontamina

ion表面灭菌！WHO6号规程《生物制品无菌规程》由WHO

1960年发布，1973年修订《中国生物制品规程》1979年版开始

定硫乙培养基双份双温度分别培养，这一规定延

到2015年版无菌检查法，成为我国生物制品无菌检查的特殊规定美国FDA（May2001）和欧盟（March1999）均接受药典无菌检查法适用于生物技术产品及生物制品（ICHQ6B，生物技术产品/生物制品检定规程及标准）关于阳性对照的规定阳性对照是生物实验结果判断的基本要求。—NO

CONTROL

NO

TEST！是提供方法经过充分验证和实验条件严格控制的实验室证据。2018年10月31日就这个问题专门与ICH交涉过，欧美并不是不做阳性对照，他们认为是实验室

要求，药典不用写。我们强调中国当前的现实需要药典提醒，他们表示理解。关于阳性对照的规定Lack

of

positive

controlsYour

firmdid

n

t

usepositivecontrols

duri

g

microbiologicaltesting

to

ensure

thereliability

of

your

testresults.When

apositivecontrol

isnot

usedduringte

ting,

testresults

cannotbeconsidered

valid

becausethe

absofmicrobial

growth

couldbe

dueto

media

lacking

theappropriatenutrentcomposition,watercontent,purity,

or

incubation

conditionsnecess

rytosupport

growth

of

themicroorganisms

thatma

bepresent

intheOTC

drugproduct

or

component

tested.应关注FDA警告信

数据完整性方面看待阳性对照的趋势。FDA调查人员对这些类型的观测将随着时间的推移而增加。•

细菌内毒素（Endotoxin），是G-菌细胞壁层上的结构，主要成分为脂多糖（lipopolysaccharide,

LPS）

由多糖O抗原、核心多糖和类脂A(lipid

A)三部分组成。细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。•

热原（pyrogen），指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。主要是指细菌性热原，是

些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。致热能力最强的是G-杆菌的产物，其次是G+杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母、甚至病毒也能产生热原。微生物过程控“中国式溯源调查”！ChP\USP\EP\JP化药终端灭菌无菌制剂参数放行【性状】【鉴别】【检查】

无菌/微生物限度【含量测定】化药非无菌制剂微生物参数放行符

性标准风险评估基于风险评估的微生物标准•

如何保证微生物实验结论的可靠性？实验室结论与调查结论的衔接问题！当一个实验室下一个不合格结论的时候，这已经不是一个实验室的问题！基于风险评估的微生物标准检不检沙门？含不含原粉？麸炒算不算炮制？限度还是无菌？稀释几级？•

如何建立一个合适的微生物标准？方法+限值（项目）平行几份？？？？中检院目前技术服务项目中检院远期技术服务项目基于风险评估类确定

项目，永远不要问检查官或监管方该不该做！–

位体积中的菌落数（cfu/g或mL）发生的概率分布服从泊松分布（Poisson

Distribution）。–

标准以指数形式更能客观的反映样品中存在微生物的水平。–

中国药典标准结果判断总体上遵从全数字比较。352015年版药典微生物计数法标准：不

定复试要求，通过实验室调查回顾分析结果的准确性。限度标准以指数方式表示，最大可接受限度值遵守2倍规则：101cfu：

接受的最大限度为20；102cf

：

可接受的最大限度为200；依此类推。—USP<1227>ValidationofMicrobial

Recovery37•

12.

Test

repor

s•

12.1

Iftheresul

oftheenumeration

isne

ative,

it

should

bereported

as“notdetected

foradefinedunit”or“lessthanthedetection

limit

foradefi

dunit”.

Theresult

shouldnotbegivenas“zeroforadefin

d

unit”unless

itisaregulatory

equirement.

Qualitative

test

results

shouldbereported

as“dd/notdetected

in

a

efinedquantity

or

volume”.

Theymay

also

beexpressed

as“lessthanaspecifiednumber

oforganisms

foradefinedunit”wherethespecified

number

oforganisms

exceedsthedetection

limit

ofth

method

andthis

hasbeen

greed

with

theclient.

Intherawdata

theresultshould

notbegivenaszero

for

adefinedunitunless

itisareg

latory

requirement.

A

reported

valueof“0”

may

beusedata

entry

andcalculations

ortrend

analysis

inelectronic

databases•

12.2

Where

anestimate

oftheuncertainty

of

thetest

result

ise

pressed

on

thetest

report,

anylimitations

particularly

if

theestima

e

doesnotincludethecom

onent

contributed

bythedistributionof

microorganisms

within

thesample)

havetobemade

clear

to

theclient.—WHO

good

practices

for

pharmaceutAnnex

2）icrobiology

laborator

s（WHO

Technical

Report

Series,

No.961,

2011，案例：某板蓝根冲剂，标准为细菌数不得过1000cfu/g，某药检所细菌数结论1200cfu/g，送中检院仲裁。方法

用性平皿法（1：10供试液）计数结果（cfu/g）1ml/皿0.5ml/皿0.2ml/皿6509101380合格不合格注射剂的微生物过程控制的分解源头：饮片、辅料、包材过程：设备、人员、环境工艺：物理参数验证与微生物学验证监控、

S、……微生物限度问题！如何认识微生物限度标准的本质和意义？通过特定的方法（培养观察）分别从质（特定微生物种群与类别）和量（微生物数量或荷载）界定微生物的风险。如何建立一个合适的微生物限度标准？（微生物限度标准=方法+限值）足于相应微生物风险控制目标需求；法规文献支持；历史数

统计分析；风险分析、效果和成本平衡原料药的霉菌数内控标准为200cfu/g,测结果为100cfu/g,制备成3.3mg/mL，霉菌内控标准为10cfu/100mL，预过滤前后霉菌的生物荷载检测结果：样品取样（3.3mg/mL）检测结果预过滤前-23m预过滤后-23ml2

CFU/10mL<1CFU/10mL如1mg/unit10g=10000unitICH(USP<61>)•

中国药典四部通则1107非无菌药品微生物限度标准：•

限度标准所列的控制菌对于控制某些药品的微生物质量可能并不全面，因此，对于原料、辅料及某些特定的制剂，根据原辅料及其制剂的特性和用途、制剂的生产工艺等因素，可能还需检查其他具有潜在危害的微生物。•

FDA的CGMP：•

21

CFR211.84(d)(6)

“Eachlotofacomponent,drugproduct

container,orclosurewithpotential

fo

microbiological

contam

nation

hatis

objectionable

inview

ofitsintended

useshall

subjectedtomicrobiological

tests

before

use.”如果任何药品中的成分、包装材料或密

件存在有微生物污染，且有可能产生不良影响，则应在每批使用前进行微生物测试。•

21

CFR211.113(a)

“Appropriatewrittenprocedures,

de

gnedtoprevent

objectionablemicroorganismsrug

productsnotrequired

tobesterile,

shallbeestablished

andfollowed.”对于非无菌产品，需要建立并执行适当的书面程序以防止不可接受微生物的污染。•

21

CFR211.165(b)

“Theres

allbeappropriate

laboratory

testing,

asnecessary,

ofeach

batchof

drugproduct

required

toree

of

objectiona

le

microorganisms.”在必要的情况下，应建立适当的实验室测试方法，对药品进行不可接受微生物的检测。•

什么是不可接受微生物（ObjectionableMicroorganisms）？•

不可接受微生物通常是指那些已知有明显致病性的，存在足够的数量，通过

品的给药途径可能导致患者不可接受风险的微生物。2018年3月2日中检院向国家局汇报了事

最终分析报告我国首次查处药品B.cepacia污染！《洋葱伯克霍尔

检查法的建立》——209年药品标准提高项目论文名称杂志作者状态凝胶剂中一株洋葱伯克霍尔德菌的分离、鉴定与生究药

分析杂志药物分析杂志中国药事王似锦，余萌，马仕洪等

2019年9月余萌，王似

，

仕洪等

2019年8月周发友，戴翚，马仕洪等

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