毒理-致突变外源化学物致作用

第七章外源化学物致突变作用（Mutagenesis

of

Xenobiotics)

第一节 概述**

第二节 化学毒物致突变的类型**

第三节 化学毒物致突变作用机制和

第四节 机体对致突变作用的影响

第五节 观察化学毒物致突变作用的基本方法**第五节观察化学毒物致突变作用的基本方法**一、观察项目的选择1.观察的效应终点类型突变和 畸变的检测可直接反映化学毒物的致突变性,是评价化学毒物致突变性唯一可靠的方法。将致突变试验的观察终点称为遗传学终点(genetic

endpoint)。目前已有的致突变试验，能反映的遗传学终点有:①

突变;②

畸变;③

组畸变;④DNA原始损伤。成套的观察项目通常为一组体内、外遗传毒理学试验。毒物种类和结构多种多样，致突变机理、靶不同，有的是体细胞，或生殖细胞，两者兼有。故在成套观察项目中要有两种细胞，除了从细胞水平还要从分子水平来检测化学物质的遗传毒性。致突变物种仅少数具有直接致突变作用，大多数为间接致突变作用，即需要在体内代谢活化后，才具有直接致突变作用。体内试验具有完整的活化系统，而体外试验则通过加入模拟代谢系统。化学毒物的致突变性有强，也有弱；有的在某一检测系统中是强致突变物，而在另一系统中可能是弱的致突变物。对于弱致突变物在某些系统中比较容易漏检，即出现假。选成套观察项目的原则选择的遗传毒性试验应包括每一种的遗传学终点。应包括多种进化程度不同的物种，如原核细胞，低等和高等真核细胞。选成套观察项目的原则体内试验与体外试验配合。应包括生殖细胞和体细胞

。二.常用的致突变试验(一)细菌回复突变试验(Ames试验)原理：正向突变人工诱变野生型细菌(原养型)突变型细菌(组氨酸缺陷型)回复突变试验菌株：鼠伤寒沙门氏菌我国采用1983年Maron和Ames推荐的组合菌株TA100、TA98、TA97和TA102。Ames试验常用的测试菌株菌株

检出突变TA100

置换+移码TA97

移码TA98

移码TA102

置换+移码菌株特性组氨酸营养缺陷（组氨酸需求试验）深粗糙（rfa）（甲紫抑菌试验）uvrB缺失（紫外线敏感试验）R因子自发回变方法：点式法、掺入法受试物阳性S9：指经酶诱导剂处理后

的肝匀浆，再经9000g离心分离所得上清液，加上适当的缓冲液和辅助因子。它主要含有混合功能氧化酶(MFO)随动物种属或 不同而有差异；亲核物质而可能影响试验的敏感性。S9的缺点：检出率高；灵敏度较高；经济适用；由于在测试系统加入了S9，弥补了一般试管内试验的缺点。Ames试验的优点Ames试验的缺点微生物的遗传信息仅相当于哺乳动物的1/6，结构也较简单。哺乳动物有较微生物完善复杂的DNA修复系统。遗传物质突变后较易修复，且微生物缺乏免疫功能。Ames试验的缺点对水溶性低物质可出现假

。抑菌剂可抑制细菌生长。(二)微核试验(micronucleus

test,

MNT)原理：微核(Micronucleus)的产生与 损伤有关，是或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个 ，在细胞

后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。后期不能定向在细胞质中微核来源：断片或无着丝粒 在细胞移动，而遗留在细胞质中；有丝 毒物的作用使个别或带着丝粒的环和断片在细胞 后期被留在细胞质中。微核试验(Micronucleus

test,MNT)是观察受试物能否产生微核的试验。其主要可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂。微核判别：为嗜染性与细胞核相似的圆形或椭圆形小体，一般小于间期核的1/3～1/5。可存在于各种动、植物细胞中。传统的微核试验观察骨髓嗜多染红细胞（PCE）中的微核。PCE指在红细胞成熟之前，最后一次分离后数小

时将主核排出的细胞，而微核仍保留在细胞质中。传统的微核试验的不足：有些化合物在骨髓难以达到有效浓度；骨髓PCE是动态平衡；化学毒物主要在肝脏活化，其活化中间产物有可能在达到骨髓之前

；将结果外推到其他组织应慎重！微核试验：哺乳动物试验体外试验：CHL、CHO、V79蚕豆根尖试验毛囊微核试验鱼微核试验MNNCEPCE(三)

畸变分析(chromosome

aberrationysis)观察 形态结构和数目改变称为畸变分析，又称细胞遗传学试验。它将观察细胞停留在细胞微镜检查

畸变和中期相，用显分离异常。哺乳动物受试物畸变骨髓/人外周

巴细胞或培养的哺乳动物细胞受试物畸变哺乳动物试验：小鼠骨髓细胞小鼠

细胞畸变试验畸变试验体外试验：畸变试验可观察到裂隙、断裂、断片、无着丝点环、体和环、双或多着丝点 、射。正常大鼠骨髓（四）姐妹染色单体交换试验姐妹染色单体交换（sister-chromatid

exchange,SCE）指 同源座位上DNA 产物相互交换，其频率与DNA断裂和修复有关。原理(五)果蝇伴性隐性致死试验果蝇伴性隐性致死试验（sex-linked

recessivelethaltest,SLRL）是利用隐性

在伴性遗传中具有交叉遗传性，选择黑腹果蝇为实验动物。给予雄蝇受试物，如雄蝇的X

有突变，传给F1代雌蝇，再通过F1代雌蝇传给

F2代雄蝇，使位于X

上的隐性在半合型雄蝇表现出来。(六)显性致死试验显性致死突变指哺乳动物生殖细胞目变化，出现的 卵在着床前发生结构和数和胚胎早期

。它是评价化学毒物对雄性动物的生殖细胞遗传毒性较好的方法之一，还可进一步确证体外试验或其他试验系统获得的阳性结果。(七)程序外DNA 试验正常：S期的DNA程序性DNADNA损伤：程序外DNA(八)单细胞凝胶电泳试验又称为彗星试验，此方法的优点为：检测低水平DNA损伤的敏感性高，对样品的细胞数要求少，适应性高，低花费，操作简便，使用的实验物质相对少，完成试验所需时间短。（九）观察方法的新进展1.

转

小鼠致突变检测系统转

动物是指 组中整合以实验方法导入的稳定的外源DNA，并能遗传给后代的一类动物。优点:可根据需要导入目的 ，即致突变的靶

；敏感性高；结果可靠性高。2.微核自动化检测技术流式细胞仪图象分析系统荧光原位杂交技术(fluorescence

in

situ

hybridization,

FISH)它是原位杂交(in

situ

hybridization,ISH)的一种。ISH是一种在保持组织，细胞或 原有形态结构基础上，对其位的分子生物学特殊核苷酸顺序进行检测及定。FISH是利用荧光探剂，将已标记或经特殊修饰的核酸探针与已固定的组织，细胞或染色体中DNA、RNA杂交，继而通过分析标记探针在被检对象中的显示状况而达到对特殊目标顺序进行检测、定位的目的。它无论在体细胞或生殖细胞, 细胞或间期细胞，都能检出

断裂剂，非整倍体诱发剂，并可检出 精细结构改变。对于环境中遗传毒性物质的检测，遗传病

，早期

具有积极的意义。三、致突变试验中的一些问题（一） 和阳性对照的设立对照：空白对照，或者是溶剂对照。阳性对照：已知能产生阳性反应的物质作对照。哺乳动物细胞介导S9纯化酶和 工程（二）体外试验的活化系统（三）致突变试验与

试验的关系物与非遗传毒致突变试验仅可检测出遗传毒性性非 物；假阳性：遗传毒性非

物；物检测试验中的一大类，需假

：非遗传毒性

物；致突变试验是短期与其他试验结合。（四）试验结果在毒理学安全性评价中的作用致突变试验的质量控制

设立 对照与阳性对照；

盲法观察；

资料的统计学差异；

试验结果的重现性。或灌胃量结果判定条件：（1）最高剂量应包括受试物溶解度的最大剂量。（2）各剂量组的组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的某些化学毒物。阳性结果应具有剂量—反应关系，即随剂量增加，致突变作用增加；和在一组或多组的观察值与

对照比较有显著性差异。阳性结论，即表明受试物具有致突变性，而不同致突变试验的遗传学终点不同，其所表示的含义不一。如 突变是具有导致遗传性疾病的突变，DNA修复的实际 尚不明确阳性结果判定条件：我国 《食品安全性毒理学评价程序》(1994)对遗传毒

理学试验的要求：根据受试物化学结构、理化性质以及对遗传物质作用终点的不同，并兼顾体外和体内试验以及体细胞和生殖细胞的原则，在Ames试验、小鼠骨髓微核试验或骨髓细胞 畸变试验、小鼠

畸形试验和睾丸 畸变试验中选择四项，如其中一项试验为阳性，还应在其他备选试验(V79细胞HGPRT

突变试验，显性致死试验，果蝇伴性隐性致死试验，UDS试验)中再选择两项试验进行。我国《安全性毒理学评价程序》(1995)对遗传毒理学