2022年质粒DNA的转化

..精选文档精选文档.精选文档一．实验名称：质粒DNA的转化二．实验目的：将编码目的蛋白的质粒导入大肠杆菌体内，从而大量扩增并表达目的蛋白三．实验原理：转化是将外源DNA分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶〔R-，M-〕。将对数生长期的细菌〔受体细胞〕经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子〔带有异源DNA分子的细胞〕四．实验步骤;1.把固态培养基加热融化，由于温度较热用自来水冲洗瓶身降温〔十度左右会再凝固，所以不能冲洗太久〕，在超净台中参加千分子一的AP〔本质粒具有抗AP性，故AP能抑制别的细菌生长〕，然后向平皿中倒入少许〔大约5毫升〕培养基，说明自己名字2.到-80℃冰箱取出质粒〔每瓶100微升，可制作两板〕迅速放入冰盘保存，放入4℃保存30min3.将上述混合物放在42℃水浴锅中融化90s〔据经验42度90s最适合〕，在超净台中用针尖沾取少许质粒放入大肠杆菌EP管内〔质粒为提纯多的所以加很少，一般未提纯的加1微升〕，再加200微升无抗培养基，加完后放回冰盘〔热：壁通透性大，冷:通透性小，起封闭作用〕放入摇床15min。4.摇完后用微量加样枪析出滴到制作好的培养皿的中央，然后慢慢铺满平皿底部〔千万不能滑到边缘，由于量比较少，滑到边缘就不容易再铺〕，说明细菌名称，实验时间，放入4℃温箱隔夜保存5.观察有稀疏斑点状菌落，从4度冰箱取出培养基，在超净台中，取四支带帽试管〔表有黄线者为抗AP〕分别倒入培养基至黄线处；用过火的镊子夹取黄枪尖〔枪尖过火要快以防烧焦〕按象限沾取菌落一枚，放入试管中，注意整个过程要过火。6.将试管放入摇床中，未完待续五．实验结果:六．本卷须知：1.培养基溶解后冲洗降温不要太久以免再凝固2.取质粒尽可能的一直放入冰盒3.42度90s4.铺板要匀！！！【原理】转化是将外源DNA分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶〔R-，M-〕。将对数生长期的细菌〔受体细胞〕经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子〔带有异源DNA分子的细胞〕。本实验采用CaCl2法制备感受态细胞。其原理是细胞处于0～4℃，CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞外表，经42℃90秒热激处理，促进细胞吸收DNA得合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药〔Ampr〕得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。本实验是将人Bcl-2重组质粒转化DH5α扩增菌，转化后在含Amp的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。含人Bcl-2重组质粒的DH5α菌用于质粒DNA的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物DNA。【试剂与器材】1．LB液体培养基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl加水至1L，高压灭菌消毒。2．LB固体培养基LB液体培养基中加1.5%琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。3．0.1mol/LCaCl2高压灭菌消毒或过滤除菌。4．氨苄青霉素用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml溶液，置-20℃保存。5．人Bcl-2重组质粒它是EcoRⅠ单酶切的pBluescriptⅡKS(-)载体与EcoRⅠ单酶切的人Bcl-2cDNA重组而成的，大小为4861bp，前者是一种由pUC19质粒衍生而来的具有2961bp的质粒载体。因此用EcoRⅠ酶切那么应到空载pBluescriptⅡKS(-)载体(2.96kb)和人Bcl-2cDNA片段(1.9kb)。配制成2g/1μl。6．大肠杆菌DH5α此为DNA扩增菌7．恒温水浴箱8．超净工作台9．高速冷冻离心机10．恒温摇床11．恒温箱12．消毒离心管13．消毒tips14．玻璃培养皿直径90mm15．玻璃涂布器16．95%乙醇17．标记笔【操作步骤】1．细菌感受态细胞的制备将DH5α菌种划线于LB琼脂板上，37℃培养过夜。挑取单菌落接种于5mlLB培养基中，37℃振荡培养培养过夜。次日取菌液1ml接种至含有100mlLB培养基的烧瓶中，37℃剧烈振荡培养至约2～3h，待A600值到达0.3～0.4时将烧瓶置于冰浴10～15min。将细菌转移到一个灭菌处理过的冰预冷的50ml离心管中。4000×g，4℃离心10min，弃培养基，将管倒置于滤纸使最后的残留液体流尽。加预冷的已过滤除菌的0.1mol/LCaCl2重悬菌体，置冰浴30min。4000×g，4℃离心10min，弃培养基。再加4ml预冷的0.1mol/LCaCl2，轻轻重悬菌体，置4℃冰箱12～16h。2．DNA重组子的转化大肠杆菌DH5α本实验中的DNA重组子为人Bcl-2重组质粒。在无菌条件下按每管取200μl新鲜感受态DH5α细菌置于无菌的5ml塑料离心管中，共2管，分别参加人Bcl-2重组质粒(10ng)和消毒水(作阴性对照)各5μl，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min。42℃，热休克90s，中途不要摇动离心管，每管加800μl无抗生素的LB培养基，于37℃空气HYPERLINK"://ebioe/yp/product-list-339.html