乳酸脱氢酶同工酶的分离教案

实验12乳酸脱氢酶同工酶的分离【学习目标】1.了解同工酶的概念，进行乳酸脱氢酶同工酶的分离。2.认识电泳法分离生物大分子的基本原理，尝试蛋白质的电泳分离。【教学重点】乳酸脱氢酶同工酶分离实验的原理和方法【教学难点】样品的预处理，电泳凝胶板的制备和实验分离过程。【教学方法】运用“指导——创新”实验教学模式。这种教学模式的基本含义是：以实验活动为基础，以改进、完善、设计实验为切入点，发展学生的创新能力、培养学生积极的个性特征和科学态度【教学过程】（一）引入新课蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化合物。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取蛋白质呢？（二）进行新课1.基础知识蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。缓冲溶液（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。凝胶电泳法：（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。［思考］填写下表：决定运动方向形成库仑力形成阻力决定运动速率电荷性质√电荷量√√分子形状√√分子大小√√（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。2.实验步骤：制备电泳凝胶板。依照课本P64图16组装电泳槽后，制备5ml分离胶倒入槽中。在胶的上端轻轻加入少量水，以防止生成胶的弯月面。待胶凝固后，小心倒出蒸馏水，再用滤纸吸净残留的水。将2ml浓缩胶倒入，插入数字，再加入少量水，待胶凝固后，小心倒出蒸馏水，再用滤纸吸净残留的水，拔出梳子。凝胶一定要在倒入前配制，由于电泳槽的大小不同，制作和倒入凝胶的量由教师告知。加样。取10μl血清，加入等体积40％蔗糖溶液，在离心管中混匀后，用移液器吸取15μl样品，小心加入到凹槽中，每组一槽，组间进行比较。也可取胎牛、小牛、老牛的血清比较同工酶相对百分含量的差别。电泳。装配好电泳装置，打开电源将电流调至10mA，待样品进入分离胶时，改为20-25mA，当溴酚蓝前沿距下框1-2cm时，将电流调至0，关闭电源。染色。配置LDH活性染液。电泳后，取出凝胶板，放在盛有染色液的培养皿中，在37℃水浴上保温20-30min，可看出LDH同工酶呈现蓝紫色区带。【核心解读】1.除了LDH还有哪些酶具有同工酶？(1)哺乳动物的肝脏中，己糖激酶有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4种同工酶；(2)碱性磷酸酯酶(AKP)有4种同工酶；(3)微生物中也有同工酶，大肠杆菌中天冬氨酸磷酸液酶，共有3种同工酶。同工酶有什么用途？同工酶又有什么应用？LDH同工酶的分布有明显的组织特异性，所以可以根据其组织特异性来协助诊断疾病。正常人血清中LDH2>LDH1。如有心肌酶释放入血清中，则LDH1>LDH2，利用此指标可以观察诊断心肌疾病。临床意义：(1)急性心肌梗塞发作后，早期血清中LDH1和LDH2活性均升高，但LDH1增高更早，更明显，导致LDH1与LDH2的比值升高。(2)肝炎、急性肝细胞损伤及骨骼肌损伤时LDH5都会升高。(3)患活动性风心肌湿性炎、急性病素性心肌炎、溶血性贫血、肾坏死等病LDH1也可升高。(4)恶性病变时LDH3常增高。同工酶是基因表达的产物，生物发育过程中基因的表达受时间和空间的控制，所以同工酶的研究在生理或病理变化、分子进化、育种等方面都有意义。近年来，同工酶检测在有些方面已被DNA标记所取代。但由于同工酶的检测在操作上比检测DNA简便，所以在一定程度上还可发挥作用。活性染色法能否用于定量测定，能否用于比色法测定其他生化反应？LDH活性染色法可用于溶液的比色定量测定。此法也可用于其他生化的氧化还原反应。但由于NBTH2不溶于水，在琥珀酸脱氢酶测定中，可使PMSH2与溶于水的2,6二氯酚靛酚相偶联而进行比色测定。4.同工酶能否用SDS聚丙烯酰胺电泳分离？为什么？SDS是解离剂，而许多同工酶是由2种亚基以不同比例组成的全酶，被解离后进行电泳，获得的是亚基的条带，无法显示同工酶的条带。所以同工酶不能用SDS聚丙烯酰胺电泳分离。【例题领悟】【例题1】乳酸脱氢酶能使乳酸发生下列的哪一变化（）A.乳酸脱氢产生丙酮酸B.使氧化型辅酶NAD＋分解C.使乳酸氧化生成CO2、H2OD.使乳酸分解成乙醇解析：本题考查乳酸脱氢酶的作用。根据教材中对其的描述，乳酸脱氢酶(LDH)可以发生以下变化CH3－CHOH－COOH＋NAD＋eq\o(,\s\up7(LDH))CH3－CO－COOH＋NADH＋H＋(乳酸)(氧化型辅酶NAD＋)(丙酮酸)所以，正确的答案是A。答案：A将乳酸脱氢酶的反应式搞清楚，尤其是各物质的分子简式。【例题2】下面对同工酶概念的说法，正确的是（）A.能将不同物质催化反应为同一物质的一组酶B.能催化同一化学反应，但其酶蛋白分子的组成却不同的一组