血清学实验技术

关于血清学实验技术第1页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六概述定义：免疫学技术是根据抗原抗体特异性结合原理建立的各种检测、分析技术的总称分类：体外免疫检测技术：常以免疫血清作为抗体的来源，故又称为血清学试验细胞免疫技术：用于检测和研究集体的细胞免疫功能与状态免疫制备技术：如抗体制备、纯化、标记技术等第2页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六血清学试验类型凝聚性试验：凝集试验，沉淀试验标记抗体技术：荧光、酶、放射性同位素标记技术等有补体参与的试验：补体结合试验等中和试验：病毒中和试验等免疫转印技术免疫传感器技术第3页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六血清学反应的一般特点特异性与交叉性:抗原抗体结合的特异性是抗原分析和疾病诊断的基础；但不同微生物的部分共同抗原或不同抗原的相同表位可出现交叉反应，后者是区分血清型或亚型重要依据结合比例:抗原抗体结合在比例适当时才出现明显可见反应,抗原或抗体过多可抑制可见反应,称为带现象可逆性:抗原抗体结合力与非共价键性质、数量和距离有关,形成的复合物可以解离,离解常数(K)反映抗体与抗原之间的亲合力,高亲合力结合不易解离反应的阶段性:特异结合迅速(几秒-几分钟),可见反应阶段较长在凝集试验（颗粒性抗原）中，常因抗体过剩出现前带现象，故需固定抗原稀释抗体；而在沉淀试验（可溶性抗原）中，可因抗原过剩出现后带现象，故需稀释抗原第4页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六影响血清学反应的因素抗体:包括抗体动物来源、浓度(效价)、亲和性等抗原:包括理化特性(可溶性，颗粒性)和抗原表位数目及种类电解质:无电解质存在不出现可见反应(沉淀或凝集),一般用生理盐水作为抗体和抗原稀释液,有时需特殊电解质,但盐浓度过高会出现非特异性蛋白沉淀(盐析)酸碱度:反应一般在pH6-9范围内进行温度:一般在37℃或室温进行,较低温度(如4℃)出现可见反应慢,但特异性强,温度过高会使已结合复合物解离时间:出现可见反应需要一定时间,应在一定时间内观察结果或终止反应第5页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六血清学试验的优点特异性强，敏感性高检测样品用量少，预处理较简单试验方法多，可择优选用方法简易、快速可用于抗原或抗体的定性、定量、定位检测第6页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六血清学试验的应用抗原抗体定性检测:疾病诊断血型鉴定病原微生物分型鉴定抗原抗体的定量检测:抗原或抗体效价测定免疫效果跟踪检测流行病学调查其它生物活性物质定量分析抗原定位检测:借助光学和电子显微镜,在细胞和亚细胞水平研究病原微生物及其表达产物与宿主细胞的关系第7页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六凝聚性试验定义：抗原与相应抗体结合形成复合物，在电解质存在下相互凝聚成肉眼可见的凝聚物或沉淀物分类凝集试验：细菌、红细胞等颗粒性抗原或与颗粒性载体（红细胞、乳胶等）结合的可溶性抗原与相应抗体结合，在电解质参与下形成肉眼可见的凝集团块沉淀试验：可溶性抗原与相应抗体结合，在电解质参与下形成肉眼可见的沉淀物第8页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六凝集试验分类凝集性试验直接凝集性试验间接凝集性试验玻片凝集性试验试管凝集性试验生长凝集性试验正向间接凝集性试验反向间接凝集性试验协同凝集性试验间接凝集抑制试验抗球蛋白试验直接法间接法第9页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六玻片凝集试验属于直接凝集和定性试验可用于未知(待测)抗原或抗体检测快速简便，1-3分钟内观察结果，出现凝集颗粒为阳性反应主要用于细菌分型鉴定、疾病诊断（如布氏杆菌和鸡白痢检疫)和血型鉴定已知抗原阳性抗体对照阴性抗体对照待测抗体(阳性)待测抗体(阴性)第10页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六试管凝集试验多用已知抗原进行血清抗体的定性和定量（效价或滴度）检测，可用于疾病诊断和流行病学调查常用生理盐水将待测血清作倍比稀释，与等量抗原混合，反应温度和时间视抗原种类决定判断标准:++++(100%凝集),+++(75%凝集),++(50%凝集),+(25%凝集),-(不凝集),出现50%以上凝集的血清最高稀释倍数为该血清的凝集价(滴度)注意阳性和阴性对照,适当稀释待检血清以避免前带现象，有些细菌（如R型细菌）悬液不稳定，易出现自凝现象根据凝集反应原理可制备单因子血清第11页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六间接凝集试验定义：将可溶性抗原或抗体吸附在免疫无关的颗粒载体上，然后与相应抗体或抗原进行的凝集反应常用载体：红血球(间接血凝试验)和乳胶(乳胶凝集试验)等，将可溶性抗原吸附在颗粒载体表面的过程称为致敏分类：正向间接凝集试验：将抗原吸附载体检测抗体反向间接凝集试验：将抗体吸附载体检测抗原一般在微量反应板上进行可用于抗原或抗体的效价测定，具有简单、方便和较准确等优点第12页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六协同凝集试验葡萄球菌A蛋白(SPA)是大多数金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白质SPA能与人和动物(猪、犬、兔、猴、豚鼠)IgGFc片段非特异结合与抗体结合的SPA菌体称为致敏菌体,可与抗原(细菌、病毒、毒素等)发生快速凝集,称为协同凝集试验主要用于传染病的快速诊断,SPA菌体还可用于IgG纯化葡萄球菌抗体抗原第13页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六抗球蛋白(Coombs)试验本质：间接凝集试验原理：不完全抗体(单价抗体)与颗粒抗原结合不出现可见凝集反应，用单价抗体免疫动物,将获得的抗抗体与结合有单价抗体的颗粒载体混合，出现可见的凝集反应应用：初生动物自身免疫溶血性贫血诊断，布氏杆菌病的不完全抗体检测，抗组织细胞不完全抗体的检测YYYYY不完全Ab颗粒性抗原如：RBCs+=Step1+=YYYYYYYYYYYYYYYYYYYAnti-AbFcStep2第14页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六沉淀试验分类絮状沉淀试验环状沉淀试验免疫浊度测定免疫扩散试验免疫电泳对流免疫电泳火箭免疫电泳液体沉淀试验沉淀试验凝胶内沉淀试验第15页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六环状沉淀试验在小口径玻璃管内进行主要用于抗原的定性检测(如诊断炭疽病的Ascoli试验、链球菌的血清型鉴定、血迹鉴定和沉淀素的效价滴定出现白色沉淀环的抗原最高稀释倍数为该血清的沉淀价已知血清待测抗原沉淀环第16页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六免疫浊度测定原理：抗原抗体复合物在特定的稀释液中容易析出,从而发生浊度变化，当抗体浓度固定时,在一定范围内抗原和抗体混合物的浊度与抗原的量呈正比仪器及要求：需要制备标准曲线，现多与光学仪器和自动化检测系统向结合应用：可检测微量的抗原或抗体第17页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六单向单扩散试验抗原在含阳性血清凝胶中单方向扩散形成沉淀线,随扩散的进行,已形成沉淀线不断溶解并形成新的沉淀线,导致沉淀线不断前移,最终形成稳定沉淀线沉淀线距离与抗原量呈正比主要用于抗原的定量测定含已知抗体凝胶待检抗原沉淀线第18页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六琼脂凝胶扩散试验定义：将可溶性抗原和抗体在半固体琼脂凝胶中扩散，当两者相遇并达到比例适当时出现肉眼可见的沉淀线分类：单向单扩散单向双扩散双向单扩散双向双扩散（免疫扩散试验）第19页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六双向单扩散试验基本原理诊断鸡马立克氏病的羽囊琼扩试验病鸡羽毛根第20页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六免疫扩散试验原理:不同孔中的抗原、抗体在凝胶中自由扩散,由近及远形成浓度梯度,当两者相遇且比例适合时形成复合物(沉淀线)用途:主要用于复杂抗原分析第21页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六免疫电泳本质：电泳与双向免疫扩散相结合原理：琼脂的SO4--使溶液因静电感应产生正电荷,形成向负极的推力(电渗力),带正电的分子在电渗力作用下加速向负极泳动,带负电分子克服电渗力向正极泳动用途：血清蛋白的分析及疾病诊断第22页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六对流电泳本质：用电泳加速抗原抗体定向扩散原理：大部分抗原带较强负电荷,能克服电渗力向阳极泳动,IgG带弱负电荷，不能克服电渗力而向阴极移动，两者相遇时形成沉淀线应用：主要用于快速诊断第23页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六火箭电泳原理：在含抗血清的琼脂凝胶(pH8.2)中，加在阴极孔中的抗原在电泳力作用下向阳极泳动,形成浓度梯度,在与抗体比例适合处形成沉淀峰,峰的高度与抗原含量呈正比应用：主要用于抗原定量分析第24页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六免疫标记技术用酶或荧光素等示踪物标记的抗体或抗原进行反应,借助光学或酶学仪器对结果进行直接观察或自动化测定,在细胞及亚细胞水平上对抗原进行定性和定位分析第25页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六免疫荧光技术原理：用荧光素标记的抗体进行抗原抗体反应,然后在荧光显微镜下观察结果,进行抗原(如病毒感染细胞)的定性、定位研究分类：直接法：标记第一抗体，特异性高，操作简便，较快速，但一种标记抗体只能检查一种抗原，敏感性较差间接法：标记抗抗体，既能检查抗原，也能检查抗体，一种标记抗抗体能与同种所有动物的抗体结合，敏感性高，但参与加因素较多，判定结果有时较难，操作繁琐常用的荧光素：异硫氰酸荧光素(FITC)等第26页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六免疫酶技术将抗原抗体反应的特异性与酶的催化高效性相结合的一类技术可用于抗原和抗体的定性、定位或定量研究主要包括免疫酶组化染色技术和酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunosorbantassay,ELISA)第27页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六免疫酶组化染色技术原理与免疫荧光相似,主要在病例切片或培养细胞上进行常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)分为直接法(标记第一抗体)、标记抗抗体)、抗抗体搭桥法和杂交抗体法第28页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六酶联免疫吸附试验将抗原或抗体吸附于固相载体(如聚苯乙烯微孔板)上,然后与相应的抗体或抗原反应,酶底物显色后用肉眼或酶联免疫测定仪进行定性观察或定量测定主要有间接法、竞争法和双抗体夹心法应用:用于抗原或抗体的测定,进行传染病的诊断及流行病学调查;用于抗原或抗体的含量或效价测定第29页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六ELISA的结果判定肉眼:根据反应孔内液体的颜色进行定性观察仪器:P/N值判定法:被检样本(P)OD值与阴性样本(N)OD值的比值(P/N)1.5为阳性样本的平均OD值大于阴性样本OD平均值+两个标准差为阳性第30页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六放射免疫技术将抗原抗体反应的特异性与放射免疫测定的高度敏感性相结合主要有液相放射免疫测定法和固相竞争测定法主要用于微量抗原的定性和定量分析第31页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六补体结合试验包括反应系统(抗原和抗体)、补体和指示系统(被溶血素致敏的红血球)特别烦琐,影响因素多,现很少用CCC反应系统指示系统溶血反应结果判定抗体抗原补体溶血素+红细胞第32页，共36页，2022年，5月20日，5点31分，星期六免疫转印技术以标记抗体为探针的蛋白转印杂交基本过程包括待测蛋白样品的电泳分离、蛋白向杂交膜(硝酸纤维素膜)的转移、杂交膜的封闭、用标记抗体进行的杂交、洗涤和信号显示第33页，共36页，2