镍酶介绍课件

第九章镍酶第一节概述第二节尿素酶及其模拟第三节氢化酶及其模拟第四节一氧化碳脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶第五节超氧化物岐化酶第六节甲基辅酶M还原酶第一节镍及其镍酶的概述镍Nickel原子序数：28，位于过渡系的中央，主要稳定氧化数+2,能和许多生物学上感兴趣的物质相结合、螯合或键合形成配位数为4、5、6的配合物。地壳中的丰度为0.018%,排在21位。土壤中含量约在40mg/kg，海水中含量3纳克/L。物种mg/g(干重）物种mg/g(干重）莴苣3.5±2.9欧芹2.7±1.7合叶子草1.9±1.3玉米1.1±0.5洋白菜1.2±0.8甜菜类1.5±0.6一些植物中的镍含量Ni的概述

在化学化工领域，镍具有独特的催化氧化还原作用，在生物体内，镍存在于多种氢化酶中，催化氢的氧化还原反应，另一方面，镍是多种酶的激活源，参与多种酶蛋白的合成。

1855年，Forehhammer首次在植物中找到镍。1925年Berg、Bertrand和Macheboeuf发现动物体内含镍。人们很早就猜测镍是动物(包括人)所必需的微量元素，但由于早期研究对饮食中金属量的控制技术不完善，结果不可靠，因而未得到肯定的结论;随着分析技术的发展，到1974年已基本证明了镍的必需性。

吸烟与肺癌

在香烟中含有49种微量元素，其中含量较高，危险最大的是镍和镉。烟中的镍能与烟雾中的一氧化碳结合成为强致癌性的羰基镍。同时，烟中镍及其氧化物对肺和呼吸道有刺激和损害作用，它们显然与肺癌，喉癌、舌癌和鼻咽癌等有密切的关系。许多国家的肺癌死亡率正在迅速上升。根据近20个国家的资料证明，吸烟是明显引起肺癌的一个重要原因。

镍与鼻咽癌

鼻咽癌在我国南方人群中发病率较高。广东省是世界上突出的鼻咽癌高发中心。而广东的鼻咽癌死亡率的分布有非常明显的地区性。广东省地质矿产局研究了地质地理环境中微量元素与鼻咽癌死亡率分布的关系，发现在鼻咽癌高发区的河水中的镍含量比相对低发区高，镍含量与鼻咽癌死亡率呈正相关。

镍可能是白血病致病因素之一!!!

急性和慢性白血病患者血清镍含量均明显高于健康人。急性白血病初期便有血清镍明显升高，随着病情进展而持续增高，当病情缓解时则明显降低。血清镍含量与慢性白血病的病情变化始终呈正相关。急性白血病血清镍升高比慢性白血病更明显，且血清镍含量过高的患者生存时间较短，提示镍可能是急性白血病的促发因素。血清镍测定可作为急性白血病病因诊断辅助指标并可作为病情严重程度及预后判断指标。镍在动物体内的主要作用

镍的生物功能主要是参与代谢及细胞膜的结构。镍具有刺激生血机能的作用，能促进红细胞的再生，也发现镍对凝血过程中易变因子的稳定性也有一定的作用。已经发现，镍大量存在于DNA和RNA中，其作用可能是通过与DNA中的磷酸酯结合，使DNA结构处于稳定状态，影响DAN的合成，RNA的复制及其它蛋白质的合成。镍在植物中的主要作用

镍最明确的生物功能是在脲酶中的作用。脲酶存在于许多植物、藻类、真菌及细菌中。脲酶种类繁多，都含有镍，但含镍的数量互相有差异。Ni的生物功能早在1975年就引起了人们的广泛关注，因为当时发现尿素酶的活性中心含有Ni，自然界选择镍作为酶的活性中心非常令人惊奇，因为Zn是比Ni更能好的Lewis酸，而Fe和Cu的单电子氧化还原在生物学中也极为普遍。在大气中O2变得丰富以前，许多过渡金属都以硫化物的形式存在，而在这些过渡金属硫化物中NiS更可溶，这也许是自然界选择镍作为酶的活性中心的原因之一。1926年就结晶分离出尿素酶，但50年之后人们才通过分光技术测得酶活性中心二价Ni的存在。此后又有一系列含镍的酶被发现，下面仅简要介绍几种常见的镍酶：①尿素酶;②氢化酶;③一氧化碳脱氢酶/乙酰辅酶A合成酶;④甲基辅酶M还原酶;⑤镍超氧化歧化酶Activesiteofurease

Ni2:

Ni-Ni(3.5Ả);Ni1:2His,1Lys(bridge);Ni2:2His,1Lys(bridge),1Asp;

1995，Unclear

1999，rightStructure，1999,7:205–216Bacilluspasteuriiureaseisatrimeroftrimers

Hydrolysismechanismofurea乙酰氧肟酸乙酰氧肟酸

脲酶抑制剂

脲酶抑制剂是指能够直接或间接抑制脲酶活性的一类物质，大体上可分为天然和人工合成两大类，目前使用较多的属人工合成的有机化合物。常用的有乙酰氧肟酸（AcetohydroxamicacidAHA）和辛酰氧肟酸（CaprylohydroxamicacidCHA），其中AHA是目前认为最有效的一种脲酶抑制剂，国内外已有工业化合成AHA的成熟技术，我国已批准AHA作为饲料添加剂使用。在目前家畜的营养中，蛋白质是最短缺的营养物质。由于反刍动物能利用非蛋白氮（NPN）合成微生物蛋白（MCP）供机体利用，因此尿素可用作反刍动物的蛋白质资源。但尿素在瘤胃内的分解速度很快，极大地限制了反刍动物对其的利用，为提高尿素等NPN的利用率，国内外学者做了大量工作。通过使用脲酶抑制剂，延缓尿素的释放，提高其利用率以充分利用氮源。为什么使用脲酶抑制剂？第一，添加尿素可代替部分价格较贵的饼粕类蛋白质饲料，节约了蛋白质饲料，降低饲料成本。脲酶抑制剂的使用可提高尿素的利用率。第二，即使日粮中不含尿素，使用脲酶抑制剂，同样具有增加微生物蛋白质合成量，节约蛋白质饲料的效果。这是因为约80％的蛋白质在瘤胃内降解成氨，同样也受脲酶催化，而瘤胃微生物利用氨的速度相对较慢，导致两种速度不协调而使大量氨不能被微生物利用造成氮源浪费。第三，在农业生产中，脲酶抑制剂的使用同样可提高植物对尿素的利用率。脲酶抑制剂的种类及其抑制机理1.1氧肟酸类化合物1.2二胺、三胺类化合物1.3重金属类1.4丝兰提取物1.5醌类化合物1.6异位酸类化合物1.7多聚甲醛大体分为两个途径：一是使脲酶结构发生变化，而使脲酶变性失活，此类抑制剂包括重金属盐类和多聚甲醛；二是与脲酶的活性中心相结合，使之失活，从而达到控制氨气释放的作用。尿酶的模拟尿素酶的模型化合物已有不少报道，虽然从羧酸根桥连双核镍结构特征来看与活性中心的结构相似，但在生物催化功能方面仍有很大差距，这方面的工作仍有很大空间。两个尿素酶模拟物的结构：[Ni2(OAc)2(tmen)2](OTf)[Ni2(Hshi)(H2shi)(Py4)(OAc)]第三节氢化酶(hydrogenase)1931年，Stephenson和Stickland首先发现了氢化酶。它们广泛存在于原核生物及低等真核生物体内。其催化作用是可逆分裂和重组氢分子。氢化酶自20世纪70年代以来就引起科学家的高度重视。酶的模拟工作寄希望于得到燃料细胞（电池），或利用类似的功能模型化合物通过光的作用产生氢能源。因此对这类酶活性中心结构和催化机理方面的研究一开始就引起广泛关注。各种氢化酶在它们的蛋白结构和所利用的电子载体的种类（如铁氧化还原蛋白，红素氧化蛋白和奎宁等）上有着很大的差异。目前发现的氢化酶有：NiFeSe，NiFe，FeonlyandMetalfree其中对镍铁氢化酶研究的最为深入。镍铁氢化酶

四类氢化酶中NiFe氢化酶的研究最为广泛和深入。迄今为止其活性中心结构已基本弄清楚，对其催化机理也提出很多合理方案，但还有待进一步确证。在化学模拟方面，虽做了大量研究，也取得了很多成果，但要达到利用类似结构的功能模拟配合物通过光作用产生氢能源H2的目的，还有很长的路要走。这一节将主要介绍国际上对NiFe氢化酶的活性中心结构、催化机理及化学模拟研究的一些成果。CoordinationChemistryReviews249(2005)1609

镍铁氢化酶为异二聚酶，两个亚基紧密相连形成一个近乎球星的分子。较大的亚基含有两个Cys-X-X-Cys氨基酸序列，一个在N端附近，另一个在C端附近,都含有Cys并与活性中心成键;而较小的亚基是铁蛋白类物质，含有几种在排列上非常适合构成Fe/S簇的半胱氨酸残基序列。小亚基有三个不同的类型的Fe/S簇，它们呈线性排列，相距1.2nm，远端为Fe4S4簇，中间为Fe3S4簇，近端为Fe4S4簇，距镍中心1.3nm。Fe/S簇和活性中心的位置显示在活性中心和小亚基表面有一个易于电子运输的通道。NiFe活性中心在大亚基上，也含有铁离子簇。Ni-Fe相距0.29nm,两个Cys通过硫桥连两个金属。另外，O2

或H2O所提供的氧原子作为桥连配体的可能性也是存在的。Nickel-ironhydrogenasestructure

[Fe4S4]dist=bottom,[Fe3S4]=middle,[Fe4S4]prox=top,Ni-Fecentre=toprightX=SorO;Y=OorNSpeciesNiterminalligandsNi-FebridgingligandsFeterminalligandsDesulfovibriogigasS

(Cys­65,Cys­530)S

(Cys­68,Cys­533);O;(H¯)CO,CN¯,·NO,N2orCCH¯DesulfovibriovulgarisMiyazakiS

(Cys­81,Cys­546)S

(Cys­84,Cys­549);SorO;(H¯)L1=SO;L2,L3=COorCN¯Schematicshowingthereactionofhydrogenandoxygenwithinahydrogenasemolecule.Thestudyofgaspathwaysinproteinscouldbeimportantforfutureapplicationsinareassuchasrenewableenergysources,butitiscurrentlynotwellunderstoodandrequirestheanalysisoflargenumbersofproteins.Howarethereadyandunreadystatesofnickel-ironhydrogenaseactivatedbyH2?Phys.Chem.Chem.Phys.,2006,

8,4086-4094

FeFe

hydrogenase

SynthesisoftheH-clusterframeworkofiron-onlyhydrogenase,Nature,2005,433,610

第四节一氧化碳脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶

一氧化碳脱氢酶(CODH)实际上有两种类型：一种含有一氧化碳脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶(ACS)两种亚基，虽然两个亚基可以分开，但分开的ACS亚基不具有活性；另一种只含有CODH亚基。一氧化碳脱氢酶催化CO的双电子氧化还原反应：

CO+H2OCO2+2H++2e

对于这种酶的，Ni不是必需的。需氧微生物使用一种含有Mo,Fe和黄素的酶在呼吸时氧化CO，而厌氧微生物则利用含有Ni和Fe/S簇的酶去氧化CO。产乙酸菌利用CO和一种提供甲基的化合物(CH3CoFeSP)及辅酶A去合成乙酰辅酶A。

CH3-CoFeSP+CO+CoAacetyl-CoA+CoFeSP

需氧细菌中的一氧化碳脱氢酶是一类含钼（Mo）金属蛋白，需氧细菌利用它们在呼吸作用中氧化一氧化碳来获得能量。而在厌氧微生物，包括厌氧细菌和古菌中，其属于含镍（Ni）金属蛋白，在不同种属的微生物中发挥着不同的作用。特别在厌氧微生物固定一氧化碳和二氧化碳的Wood-Ljungdahl代谢途径中，一氧化碳脱氢酶可以与乙酰辅酶A合成酶（同为镍蛋白）结合形成双功能酶，共同发挥作用，将一氧化碳和二氧化碳转化为重要的代谢中间物乙酰辅酶A。

由于一氧化碳脱氢酶能够高效地催化对动物和人体有很高毒性的一氧化碳氧化为二氧化碳，因此对于其催化机理的研究有助于治理环境中的一氧化碳污染。

Ni-CODH广泛存在于以一氧化碳为碳源和能源的厌氧微生物中，如乙酸生成细菌（acetogenicbacteria）、光养细菌（phototrophicbacteria）、氢气生成细菌（hydrogenogenicbacteria）、硫酸还原细菌和古菌（sulfate-reducingbacteriaandarchaea）以及甲烷生成古菌（methangenicarchaea）。

不同来源的Ni-CODH差别很大：既有单功能的一氧化碳脱氢酶只负责催化CO的氧化；又有双功能酶，即同时具有一氧化碳脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶（ACS）的活性，生理状态下需要Ni-CODH与ACS结合共同发挥功能。因此，又常常以CODH/ACS复合物的名称来代替Ni-CODH。与Mo-CODH相似的是，CODH/ACS也需要形成二聚体来发挥催化作用。

从热醋酸棱菌中提纯得到的一氧化碳脱氢酶研究得较为清楚，它包括有6个镍离子，三个锌离子、32～40个铁和硫化物硫原子。一氧化碳脱氢酶是从甲烷菌和醋酸菌中两个碳碎片合成乙酰辅酶A的关键催化剂，这种酶也是醋酸营养细胞中醋酸酯碎片降解作用过程的中心，这一过程到CH4和CO2终止。ACSisolatedfromM.thermoaceticaisa310kDa*α2β2tetramer(itismadeoffourstrandsofprotein:twoidenticalstrandscalled'alpha'andtwocalled'beta').

Eachαβdimercontainsthreemetal-sulfurclusterscalledA,B,andC.

TheA-clusterislocatedinthe81kDaαsubunitwhiletheB-andC-clustersarefoundinthe71kDaβsubunit.一氧化碳脱氢酶(CODH)一氧化碳脱氢酶的晶体结构分析表明，它是有两个完全相同的相互缠绕的亚基共价连接而成。每个亚单位都含有Ni,Fe和S组成的杂金属簇(C簇)，整个酶分子呈蘑菇状。在C簇中，一个镍原子，四个铁原子和五个易变的硫原子排列为不对称的[Ni-4Fe-5S]簇。C簇中的金属离子与五个半胱氨酸残(Cys295,Cys333,Cys446,Cys476,Cys526)和一个组氨酸残基(His261)通过共价键相连。所有的铁原子都与硫原子形成四面体配位方式，镍与四个硫原子配位通过μ2-S和μ3-S与铁桥连。镍中心为畸变平面四方形配位方式。第五节镍超氧化物歧化酶Ni-SOD主要从各种细菌中分离得到。Ni-SOD与其他SOD的主要区别在于氨基酸组成上的不同。它除了含有大量的甘氨酸外，半胱氨酸残基也有所不同。

Ni是催化超氧化物歧化反应的中心，如果将Ni从酶中除去，酶蛋白只剩下了残基活性。NiSOD的晶体结构已经报道。其中6个螺旋束以头尾-头尾的形式