gP96多肽复合物／树突状细胞疫苗研究课件

gP96多肽复合物／树突状细胞

疫苗的实验研究gP96多肽复合物／树突状细胞

疫苗的实验研究北京大学人民医院胸部微创中心胸外科博士研究生：李运导师：王俊教授

gP96多肽复合物／树突状细胞

疫苗的实验研究gP96多肽复研究背景研究背景全世界肺癌病例1910年<200例1912年374例1920年956例（美国）新增肺癌病例肺癌死亡病例1997年178，100160，4002002年169，400154，9002003年171，900157，200发病占全部肿瘤发生的15%，死亡占全部因肿瘤死亡病例的29%全世界肺癌病例1910年<200例1912年374例1920整体疗效与30年前比较没有明显提高，总的五年生存率仍不足15%整体疗效与30年前比较没有明显提高，总的五年生存率仍不足15肿瘤抗原免疫系统特异性抗原识别破坏和消灭肿瘤细胞抗原呈递系统肿瘤抗原免疫系统特异性抗原识别破坏和消灭肿瘤细胞抗原呈递系统HSPs具有结合细胞内抗原性多肽的能力，可以带有肿瘤细胞内全部抗原肽具有该细胞特有的抗原库的作用,称为“分子伴侣”抗原gP96HSPs具有结合细胞内抗原性多肽的能力，可以带有肿瘤细胞内全经典的外源性抗原呈递途径gP96介导的外源性抗原呈递途径通过MHC-II类分子激活CD4+T淋巴细胞通过MHC-I类分子激活CD8+T淋巴细胞经典的外源性抗原呈递途径gP96介导的外源性抗原呈递途径通过途径激发人体有效的特异性抗肿瘤免疫功能树突状细胞体内最强的抗原呈递细胞途径激发人体有效的特异性抗肿瘤免疫功能树突状细胞体内+>>gP96orDC科研工作新问题单方面要素两方面要素gP96多价性特异性（抗原库）DC识别抗原激活细胞免疫（专职抗原呈递细胞）+>>gP96orDC科研工作新问题单方面要素两方面研究内容研究内容肺癌组织提取gP96SDS—PAGE凝胶电泳、银染鉴定、Western印迹分析蛋白定量分析RT-PCR检测RNA水平表达免疫组化检测蛋白水平表达第一部分gp96多肽复合物提取鉴定在肺癌组织中表达的研究肺癌组织gP96提取和鉴定；肺癌组织和正常组织gP96的表达水平；[目的][流程]肺癌组织提取gP96第一部分gp96多肽复合物提取鉴定定量分析测得所提取的gp96蛋白浓度在0.1µg/ul左右，相当于50-80ug/g组织。定量分析测得所提取的gp96蛋白浓度在0.1µg/ul左右，肺癌组织细胞浆中有棕黄色颗粒聚集

正常肺组织中细胞苏木素染色阴性

同一患者标本

GeneN(x±s)T(x±s)tvaluepvaluegp960.6725±0.47131.110±0.4467-4.318<0.001肺癌组织细胞浆中有棕黄色颗粒聚集正常肺组织中细胞苏木素染色外周血单个核细胞提取及体外扩增流式细胞仪鉴定gP96与树突状细胞共孵育制备疫苗体外CTL反应，INF-γ浓度淋巴细胞表型分析第二部分gP96多肽复合物/DC疫苗体外诱导CTL反应实验研究外周血来源DC培养和鉴定gP96多肽复合物/DC疫苗的制备gP96/DC体外实验

[目的][流程]外周血单个核细胞提取及体外扩增第二部分gP96多肽复合培养2-3天后的DC

培养7天后的DC

培养2-3天后的DC培养7天后的DCA-1．培养前CD1a-A-2.培养后CD1a+

B-1.培养前CD86-B-2.培养后CD86+C-1.培养前CD83-C-2.培养后CD83+D-1.培养前CD80-D-2.培养后CD80+E-1.培养前CD14+E-2.培养后CD14-

CD14-；CD80+；CD83+；CD86+

A-1．培养前CD1a-A-2.培养后CD1培养前淋巴细胞的CD3培养10d后淋巴细胞的CD3培养前淋巴细胞的CD4、CD8培养10d淋巴细胞的CD4、CD8CD3/CD8＋T细胞明显增加；CD8＋/CD4＋细胞比例增加培养前淋巴细胞的CD3样本ELISA反应的OD值(X±S)释放IFN-γ的量（pg/ml）gp96/DC2.244±0.1334150.835gp961.674±0.1623066.847DC0.126±0.011122.966样本ELISA反应的OD值(X±S)释放IFN-γ的量（pg建立动物模型以制备的疫苗免疫动物并种植肿瘤观察成瘤率，肿瘤体积，动物生存时间第三部分gP96多肽复合物/DC疫苗

动物体内实验研究

gP96/DC在小鼠体内的抑制肿瘤生长作用的研究[目的][流程]建立动物模型第三部分gP96多肽复合物/DC疫苗gPgP96多肽复合物／树突状细胞疫苗研究课件LA795肺癌肿瘤组织提取Gp96小鼠外周血615小鼠肺癌模型Gp96/DC，Gp96，DC提取DC细胞观察肿瘤生长情况及对小鼠生存期的影响LA795肺癌肿瘤组织提取Gp96小鼠外周血615小鼠肺癌模SCID小鼠PAa肺癌肿瘤组织提取Gp96人外周血免疫重建小鼠荷人肺癌免疫重建小鼠Gp96/DC疫苗提取DC细胞观察肿瘤生长情况及对小鼠生存期的影响SCID小鼠PAa肺癌肿瘤组织提取Gp96人外周血免疫重建小100%75%615小鼠肿瘤植入后不同时间的肿瘤体积（x±scm³）组数处理动物数肿瘤植入后天数212835Ⅰ种植102.63±0.876.46±1.478.04±1.40ⅡGP9680.33±0.27※0.70±0.62※1.49±1.17※ⅢDC80.30±0.22※0.64±0.49※1.16±0.92※ⅣGP96+DC80.21±0.22※△0.32±0.30※△0.62±0.30※△615LA795※：与Ⅰ组比较，P<0.05。△：与Ⅱ组和Ⅲ组比较，P<0.05

100%75%615小鼠肿瘤植入后不同时间的肿瘤体积（x±s※：与Ⅰ组比较，P<0.05。△：与Ⅱ组和Ⅲ组比较，P<0.05

615小鼠肿瘤植入后的生存时间组数处理动物数肿瘤植入后生存天数Ⅰ种植1052ⅡGP96851.5ⅢDC858.5※ⅣGP96+DC877※△※：与Ⅰ组比较，P<0.05。615小鼠肿瘤植入后的生存时SCIDPAa※：与Ⅰ组比较，P<0.05。△：与Ⅱ组和Ⅲ组比较，P<0.05

SCID小鼠肿瘤植入后不同时间的肿瘤体积(X±Scm³)组数处理动物数肿瘤植入后天数212832Ⅰ重建160.38±0.120.75±0.300.90±0.33ⅡGP9680.09±0.06※0.17±0.06※0.22±0.11※ⅢDC80.08±0.06※0.15±0.08※0.24±0.11※ⅣGP96+DC80.03±0.03※△0.08±0.08※△0.12±0.13※△87.5%100%SCIDPAa※：与Ⅰ组比较，P<0.05。SCIDSCID小鼠肿瘤植入后的生存时间组数处理动物数肿瘤植入后生存天数Ⅰ重建1637ⅡGP96852※ⅢDC852.5※ⅣGP96+DC8＞62※△SCID小鼠肿瘤植入后的生存时间组数处理动物数肿瘤植入后生存gP96多肽复合物／树突状细胞疫苗研究课件讨论讨论gP96在肺癌中的表达基因表达的检测

mRNA水平：原位杂交、NorthernBlot、核酸酶保护分析Real-timeRT-PCR、、半定量RT-PCR。蛋白水平。

方法比较原位杂交仅能提供mRNA在细胞内的定位信息，不能确定mRNA的含量，受人为因素影响大，无法检测极微量的mRNANorthernBlot敏感性低，样品用量大，对实验条件要求高，需要应用放射性物质，不适合检测低丰度的mRNAReal-timeRT-PCR仪器和试剂盒价格昂贵，标准物难以获得核酸酶保护分析操作复杂，价格昂贵半定量RT-PCR

高度敏感、准确、简便、快捷、对仪器要求低、可重复性强、易于掌握gP96在肺癌中的表达基因表达的检测mRNA水平：原位杂交与正常组织相比，肺癌组织中编码gp96的基因在mRNA水平的表达明显增高的。这进一步证实了在罹患肿瘤时，以gp96为代表的HSPs合成明显增加，这是机体受到肿瘤刺激产生的热休克反应，以此来维持细胞内环境的稳定，是机体的一种保护性反应。半定量RT-PCR法mRNA水平gP96肺癌组织正常肺组织免疫组化法蛋白水平引物设计循环次数操作中注意：模板内对照与正常组织相比，肺癌组织中编码gp96的基因gP96的提取

提取gP96的经典方法（Srivastava）：饱和硫酸铵沉淀刀豆球蛋白A亲和层析DEAE离子交换层析（提取率估计在20-30%，蛋白提取量在15-150ug/g组织）存在的普遍问题：蛋白提取率低，尚无法满足临床需要解决：更改其中的试剂或步骤：

去除饱和硫酸铵沉淀过程，离子交换层析柱换用MonoQ或POROS20QE柱

增加组织中gP96含量：

热刺激、缺氧等物理刺激或者通过转基因技术导入gP96cDNA重组真核表达质粒以增加细胞中gP96合成量

gP96的提取提取gP96的经典方法（SrivastavaDC的来源来源培养方法建立比较脐带血1992肿瘤患者多无法获得外周血

1994取材容易，操作简单，，DC生成量大，纯度高，可以反复进行，患者痛苦小，便于临床应用，是目前获得DC的较理想的途径。骨髓1995穿刺操作复杂，获得细胞量少，需多点反复操作，可能会增加创伤，给患者造成极大的痛苦DC的来源来源培养方法建立比较脐带血1992肿瘤患者多无法DC的分离和培养分离纯化DC的方法物理方法根据细胞的黏附性进行分离黏附分离法、尼龙毛分离法和羰基碳分离法等根据细胞比重进行分离葡聚糖-泛影葡胺（Ficoll）密度梯度离心、Percoll非连续性/连续性密度梯度离心及E花环沉淀分离等方法免疫分选淘洗法、流式细胞技术、磁性细胞分离术等方法密度梯度离心获取单个核细胞富集前体DC细胞因子体外扩增培养DC的分离和培养分离纯化DC的方法物理方法根据细胞的黏附富集前体DC：去除粒、单核、T、B、NK和巨噬细胞方法特点黏附法直接黏附法对细胞干扰小，DC获得率高间接黏附法培养体系小，节省细胞因子，细胞损伤大，DC获得率低单抗法免疫磁珠和流式细胞技术需要大量的特殊抗体，细胞损失量大，价格昂贵，细胞因子作用必需GM-CSF促进DC增殖，是最基本的因子IL-4抑制中性粒细胞和巨噬细胞增殖争议TNF-α促进DC成熟，抑制粒细胞产生Flt3L促进DC增殖，抑制DC分化其他LPS、CD40L、INF-β、INF-γ及IL-1β等富集前体DC：去除粒、单核、T、B、NK和巨噬细胞方法特点黏方法备注形态结构相差显微镜、电镜直观分子表达CD1a、CD80、CD86、CD40和CD83等，特别是CD83--树突状细胞的标志性分子准确功能状态混合淋巴细胞反应DC的鉴定方法备注形态结构相差显微镜、电镜直观分子表达CD1a、CD8关于动物肿瘤模型动物模型的优越性：避免了在人身上进行实验所带来的风险临床上少见疾病可用动物随时复制出来研究周期短，节省时间，克服人类某些疾病潜伏期长，病程长和发病率低的缺点可在人为控制条件下进行实验可以严格控制实验条件，增强实验材料的可比性取材方便，可以简化实验操作和样品收集成本低有助于更全面地认识疾病的本质关于动物肿瘤模型动物模型的优越性：避免了在人身上进行实验所带按产生原因自发性肿瘤模型实验动物未经任何有意识的人工处置，在自然情况下所发生的疾病诱发性肿瘤模型使用物理的、化学的和生物的致病因素作用于动物诱发肿瘤移植性肿瘤模型人类肿瘤移植动物按系统范围疾病的基本病理过程模型各种疾病共同的一些病理变化过程的模型各系统疾病模型与人类各系统疾病相应的模型按模型种类整体模型离体器官和组织细胞株分类按产生原因自发性肿瘤模型实验动物未经任何有意识的人工处置已建立动物模型的人类肿瘤：肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胶质瘤等常用的动物：小鼠、大鼠、兔、鸡胚等近交系小鼠：BALB/c、C57、C3H、615、T739、裸鼠、SCID小鼠等五十余种已建立动物模型的人类肿瘤：肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌SCID小鼠16号染色体近着丝点处单个隐性基因发生SCID突变基因重排异常免疫球蛋白重链T细胞抗原受体T、B淋巴细胞前体分化T、B淋巴细胞细胞免疫体液免疫免疫球蛋白缺如淋巴细胞严重减少对体外移植物免疫排斥低联合缺陷+1983年Bosma免疫重建1988年Moiser骨髓胸腺脾胎肝外周血淋巴细胞腹腔皮下免疫系统恢复且具有人类免疫系统的特征SCID小鼠16号染色体近着丝点处单个隐性基因发生SCID突与人体内环境极其类似保证了患者本身的安全带有人类肿瘤具有人类免疫系统研究肿瘤生长的理想动物模型与人体内环境极其类似带有人类肿瘤研究肿瘤生长的理想动物模型gP96/DC在体外可诱发强烈的CTL反应在体内可有效抑制肿瘤生长

gP96+DC特异性+多价性避免了肿瘤的免疫逃逸探寻机制抗原肽（小分子）DCgP96+抗原肽CD91T淋巴细胞MHC分子、共刺激分子粘附分子gP96/DC在体外可诱发强烈的CTL反应gP96+DC--体外扩增培养DC未成熟DC凋亡gP96成熟DC直接与T淋巴细胞接触发生作用未接触肿瘤抗原不需激活肿瘤抗原非专职抗原呈递细胞抗原特异性免疫耐受专职抗原呈递细胞特异性免疫防御反应体外扩增培养DC未成熟DC凋亡gP96成熟DC直接与T淋巴细结论结论gP96/DC，在动物体内可降低肿瘤成瘤率，明显抑制肿瘤生长，延长宿主生存时间属于个体化治疗方案，是未来原发肿瘤切除后微小转移灶的预防和治疗的有效措施之一

gP96在肺癌组织中RNA和蛋白水平的表达明显高于正常肺组织gP96/DC疫苗在体外可激发更强烈的CTL反应，刺激T淋巴细胞增殖，CD8+/CD4+细胞比例增加，并使T淋巴细胞IFN-γ分泌明显增加gP96/DC，在动物体内可降低肿瘤成瘤率，明显抑制肿瘤生长gP96多肽复合物／树突状细胞

疫苗的实验研究gP96多肽复合物／树突状细胞

疫苗的实验研究北京大学人民医院胸部微创中心胸外科博士研究生：李运导师：王俊教授

gP96多肽复合物／树突状细胞

疫苗的实验研究gP96多肽复研究背景研究背景全世界肺癌病例1910年<200例1912年374例1920年956例（美国）新增肺癌病例肺癌死亡病例1997年178，100160，4002002年169，400154，9002003年171，900157，200发病占全部肿瘤发生的15%，死亡占全部因肿瘤死亡病例的29%全世界肺癌病例1910年<200例1912年374例1920整体疗效与30年前比较没有明显提高，总的五年生存率仍不足15%整体疗效与30年前比较没有明显提高，总的五年生存率仍不足15肿瘤抗原免疫系统特异性抗原识别破坏和消灭肿瘤细胞抗原呈递系统肿瘤抗原免疫系统特异性抗原识别破坏和消灭肿瘤细胞抗原呈递系统HSPs具有结合细胞内抗原性多肽的能力，可以带有肿瘤细胞内全部抗原肽具有该细胞特有的抗原库的作用,称为“分子伴侣”抗原gP96HSPs具有结合细胞内抗原性多肽的能力，可以带有肿瘤细胞内全经典的外源性抗原呈递途径gP96介导的外源性抗原呈递途径通过MHC-II类分子激活CD4+T淋巴细胞通过MHC-I类分子激活CD8+T淋巴细胞经典的外源性抗原呈递途径gP96介导的外源性抗原呈递途径通过途径激发人体有效的特异性抗肿瘤免疫功能树突状细胞体内最强的抗原呈递细胞途径激发人体有效的特异性抗肿瘤免疫功能树突状细胞体内+>>gP96orDC科研工作新问题单方面要素两方面要素gP96多价性特异性（抗原库）DC识别抗原激活细胞免疫（专职抗原呈递细胞）+>>gP96orDC科研工作新问题单方面要素两方面研究内容研究内容肺癌组织提取gP96SDS—PAGE凝胶电泳、银染鉴定、Western印迹分析蛋白定量分析RT-PCR检测RNA水平表达免疫组化检测蛋白水平表达第一部分gp96多肽复合物提取鉴定在肺癌组织中表达的研究肺癌组织gP96提取和鉴定；肺癌组织和正常组织gP96的表达水平；[目的][流程]肺癌组织提取gP96第一部分gp96多肽复合物提取鉴定定量分析测得所提取的gp96蛋白浓度在0.1µg/ul左右，相当于50-80ug/g组织。定量分析测得所提取的gp96蛋白浓度在0.1µg/ul左右，肺癌组织细胞浆中有棕黄色颗粒聚集

正常肺组织中细胞苏木素染色阴性

同一患者标本

GeneN(x±s)T(x±s)tvaluepvaluegp960.6725±0.47131.110±0.4467-4.318<0.001肺癌组织细胞浆中有棕黄色颗粒聚集正常肺组织中细胞苏木素染色外周血单个核细胞提取及体外扩增流式细胞仪鉴定gP96与树突状细胞共孵育制备疫苗体外CTL反应，INF-γ浓度淋巴细胞表型分析第二部分gP96多肽复合物/DC疫苗体外诱导CTL反应实验研究外周血来源DC培养和鉴定gP96多肽复合物/DC疫苗的制备gP96/DC体外实验

[目的][流程]外周血单个核细胞提取及体外扩增第二部分gP96多肽复合培养2-3天后的DC

培养7天后的DC

培养2-3天后的DC培养7天后的DCA-1．培养前CD1a-A-2.培养后CD1a+

B-1.培养前CD86-B-2.培养后CD86+C-1.培养前CD83-C-2.培养后CD83+D-1.培养前CD80-D-2.培养后CD80+E-1.培养前CD14+E-2.培养后CD14-

CD14-；CD80+；CD83+；CD86+

A-1．培养前CD1a-A-2.培养后CD1培养前淋巴细胞的CD3培养10d后淋巴细胞的CD3培养前淋巴细胞的CD4、CD8培养10d淋巴细胞的CD4、CD8CD3/CD8＋T细胞明显增加；CD8＋/CD4＋细胞比例增加培养前淋巴细胞的CD3样本ELISA反应的OD值(X±S)释放IFN-γ的量（pg/ml）gp96/DC2.244±0.1334150.835gp961.674±0.1623066.847DC0.126±0.011122.966样本ELISA反应的OD值(X±S)释放IFN-γ的量（pg建立动物模型以制备的疫苗免疫动物并种植肿瘤观察成瘤率，肿瘤体积，动物生存时间第三部分gP96多肽复合物/DC疫苗

动物体内实验研究

gP96/DC在小鼠体内的抑制肿瘤生长作用的研究[目的][流程]建立动物模型第三部分gP96多肽复合物/DC疫苗gPgP96多肽复合物／树突状细胞疫苗研究课件LA795肺癌肿瘤组织提取Gp96小鼠外周血615小鼠肺癌模型Gp96/DC，Gp96，DC提取DC细胞观察肿瘤生长情况及对小鼠生存期的影响LA795肺癌肿瘤组织提取Gp96小鼠外周血615小鼠肺癌模SCID小鼠PAa肺癌肿瘤组织提取Gp96人外周血免疫重建小鼠荷人肺癌免疫重建小鼠Gp96/DC疫苗提取DC细胞观察肿瘤生长情况及对小鼠生存期的影响SCID小鼠PAa肺癌肿瘤组织提取Gp96人外周血免疫重建小100%75%615小鼠肿瘤植入后不同时间的肿瘤体积（x±scm³）组数处理动物数肿瘤植入后天数212835Ⅰ种植102.63±0.876.46±1.478.04±1.40ⅡGP9680.33±0.27※0.70±0.62※1.49±1.17※ⅢDC80.30±0.22※0.64±0.49※1.16±0.92※ⅣGP96+DC80.21±0.22※△0.32±0.30※△0.62±0.30※△615LA795※：与Ⅰ组比较，P<0.05。△：与Ⅱ组和Ⅲ组比较，P<0.05

100%75%615小鼠肿瘤植入后不同时间的肿瘤体积（x±s※：与Ⅰ组比较，P<0.05。△：与Ⅱ组和Ⅲ组比较，P<0.05

615小鼠肿瘤植入后的生存时间组数处理动物数肿瘤植入后生存天数Ⅰ种植1052ⅡGP96851.5ⅢDC858.5※ⅣGP96+DC877※△※：与Ⅰ组比较，P<0.05。615小鼠肿瘤植入后的生存时SCIDPAa※：与Ⅰ组比较，P<0.05。△：与Ⅱ组和Ⅲ组比较，P<0.05

SCID小鼠肿瘤植入后不同时间的肿瘤体积(X±Scm³)组数处理动物数肿瘤植入后天数212832Ⅰ重建160.38±0.120.75±0.300.90±0.33ⅡGP9680.09±0.06※0.17±0.06※0.22±0.11※ⅢDC80.08±0.06※0.15±0.08※0.24±0.11※ⅣGP96+DC80.03±0.03※△0.08±0.08※△0.12±0.13※△87.5%100%SCIDPAa※：与Ⅰ组比较，P<0.05。SCIDSCID小鼠肿瘤植入后的生存时间组数处理动物数肿瘤植入后生存天数Ⅰ重建1637ⅡGP96852※ⅢDC852.5※ⅣGP96+DC8＞62※△SCID小鼠肿瘤植入后的生存时间组数处理动物数肿瘤植入后生存gP96多肽复合物／树突状细胞疫苗研究课件讨论讨论gP96在肺癌中的表达基因表达的检测

mRNA水平：原位杂交、NorthernBlot、核酸酶保护分析Real-timeRT-PCR、、半定量RT-PCR。蛋白水平。

方法比较原位杂交仅能提供mRNA在细胞内的定位信息，不能确定mRNA的含量，受人为因素影响大，无法检测极微量的mRNANorthernBlot敏感性低，样品用量大，对实验条件要求高，需要应用放射性物质，不适合检测低丰度的mRNAReal-timeRT-PCR仪器和试剂盒价格昂贵，标准物难以获得核酸酶保护分析操作复杂，价格昂贵半定量RT-PCR

高度敏感、准确、简便、快捷、对仪器要求低、可重复性强、易于掌握gP96在肺癌中的表达基因表达的检测mRNA水平：原位杂交与正常组织相比，肺癌组织中编码gp96的基因在mRNA水平的表达明显增高的。这进一步证实了在罹患肿瘤时，以gp96为代表的HSPs合成明显增加，这是机体受到肿瘤刺激产生的热休克反应，以此来维持细胞内环境的稳定，是机体的一种保护性反应。半定量RT-PCR法mRNA水平gP96肺癌组织正常肺组织免疫组化法蛋白水平引物设计循环次数操作中注意：模板内对照与正常组织相比，肺癌组织中编码gp96的基因gP96的提取

提取gP96的经典方法（Srivastava）：饱和硫酸铵沉淀刀豆球蛋白A亲和层析DEAE离子交换层析（提取率估计在20-30%，蛋白提取量在15-150ug/g组织）存在的普遍问题：蛋白提取率低，尚无法满足临床需要解决：更改其中的试剂或步骤：

去除饱和硫酸铵沉淀过程，离子交换层析柱换用MonoQ或POROS20QE柱

增加组织中gP96含量：

热刺激、缺氧等物理刺激或者通过转基因技术导入gP96cDNA重组真核表达质粒以增加细胞中gP96合成量

gP96的提取提取gP96的经典方法（SrivastavaDC的来源来源培养方法建立比较脐带血1992肿瘤患者多无法获得外周血

1994取材容易，操作简单，，DC生成量大，纯度高，可以反复进行，患者痛苦小，便于临床应用，是目前获得DC的较理想的途径。骨髓1995穿刺操作复杂，获得细胞量少，需多点反复操作，可能会增加创伤，给患者造成极大的痛苦DC的来源来源培养方法建立比较脐带血1992肿瘤患者多无法DC的分离和培养分离纯化DC的方法物理方法根据细胞的黏附性进行分离黏附分离法、尼龙毛分离法和羰基碳分离法等根据细胞比重进行分离葡聚糖-泛影葡胺（Ficoll）密度梯度离心、Percoll非连续性/连续性密度梯度离心及E花环沉淀分离等方法免疫分选淘洗法、流式细胞技术、磁性细胞分离术等方法密度梯度离心获取单个核细胞富集前体DC细胞因子体外扩增培养DC的分离和培养分离纯化DC的方法物理方法根据细胞的黏附富集前体DC：去除粒、单核、T、B、NK和巨噬细胞方法特点黏附法直接黏附法对细胞干扰小，DC获得率高间接黏附法培养体系小，节省细胞因子，细胞损伤大，DC获得率低单抗法免疫磁珠和流式细胞技术需要大量的特殊抗体，细胞损失量大，价格昂贵，细胞因子作用必需GM-CSF促进DC增殖，是最基本的因子IL-4抑制中性粒细胞和巨噬细胞增殖争议TNF-α促进DC成熟，抑制粒细胞产生Flt3L促进DC增殖，抑制DC分化其他LPS、CD40L、INF-β、INF-γ及IL-1β等富集前体DC：去除粒、单核、T、B、NK和巨噬细胞方法特点黏方法备注形态结构相差显微镜、电镜直观分子表达CD1a、CD80、CD86、CD40和CD83等，特别是CD83--树突状细胞的标志性分子准确功能状态混合淋巴细胞反应DC的鉴定方法备注形态结构相差显微镜、电镜直观分子表达CD1a、CD8关于动物肿瘤模型动物模型的优越性：避免了在人身上进行实验所带来的风险临床上少见疾病可用动物随时复制出来研究周期短，节省时间，克服人类某些疾病潜伏期长