DNA生物合成课件讲义

§核酸的生物合成青岛农业大学生命科学学院生物化学与分子生物学教研室§核酸的生物合成青岛农业大学生命科学学院1复制的方式——半保留复制(semi-conservativereplication)复制的高保真性(highfidelity)双向复制(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication)复制的方式2一.DNA的半保留复制复制时,每一条DNA链在新链合成中充当模板，按碱基配对方式形成两个新的DNA分子，每个分子都含有一条新链和一条旧链，这种复制方式即半保留复制(semiconservativereplication)。Watson和Crick开创性的论文，对DNA双螺旋的描述以这样一段陈述结尾：“不出我们的意料，我们所假设的特异性配对立即提示一种遗传物质可能的复制机制。”

一.DNA的半保留复制复制时,每一条DNA3半保留复制亲代第一代第二代半保留复制的实验证据

1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA，首先证明了DNA的半保留复制。半保留复制亲代第一代第二代半保留复制的实验证据4重轻杂和DNA杂和DNA重轻杂和DNA杂和DNA5新链旧链DNA的半保留复制的生物学意义：DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。（但DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质。）新链旧链DNA的半保留复制的生物学意义：DNA的半保留复制表6二.复制的起点和方向

复制是一个高度协调的过程，母链解链和复制同时进行。（一）概念●复制子(replicon)：基因组能独立进行复制的单位。●起点(origin)：控制复制起始，是含有100～200个碱基对的一段DNA。细胞内存在着能识别起点的特殊蛋白质(大肠杆菌中称为DnaA蛋白)。二.复制的起点和方向复制是一个高度协调的过7●终点(terminus)：终止复制的序列位点.●复制叉(replicationfork)：复制开始后由于DNA双链解开，在两股单链上进行复制，形成在显微镜下可看到的叉状结构。●终点(terminus)：终止复制的序列位点.8DNA生物合成课件讲义9原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。复制中的放射自显影图象原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链10A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABCA.环状双链DNA及复制起始点oriterA11真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。125’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制子3’5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’13原核生物：只有一个复制子真核生物：多个复制子，多个起点，形成多个“复制眼”或“复制泡”原核生物：只有一个复制子14（二）起始点和方向1.原核生物和真核生物复制都是在DNA分子特定的位置起始的，如大肠杆菌起始点有固定的保守顺序GATC和TTATCCACA，多次出现，可被酶识别。2.方向：大多是双向、对称复制,也有单向或不对称的。3.速度：原核生物复制叉移动快(约105bp/min);真核生物复制叉移动慢(约5×102～5×103bp/min)（二）起始点和方向2.方向：大多是双向、对称复15双向复制复制叉起点起点单向复制双向复制复制叉起点起点单向复制16复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）17三.原核细胞DNA的复制(DNA指导下的DNA合成)（一）DNA聚合酶(DNApolymerase,DNA-pol)DNA聚合酶是一种催化依赖模板的由脱氧核苷三磷酸前体合成DNA的酶。1956年Arthurkornberg等首先从大肠杆菌中发现DNA聚合酶，其后在广泛不同的生物中都找到有这种酶。三.原核细胞DNA的复制(DNA指导下的DNA合成)（一）18DNA聚合酶的反应特点：♦

4种dNTP底物：(dATPdGTPdCTPdTTP)；♦接受模板指导:解开成单链的DNA母链；♦需引物提供3′-OH；♦新链生长方向：5′→3′；♦产物DNA性质与模板相同。DNA聚合酶的反应特点：19

此外,DNA复制过程中还需其它酶和蛋白质因子.模板DNA链引物新加入的dNTP脱氧核糖亲核攻击5′3′生长的DNA链*引物(primer)是一和模板链互补的线性片段,其上带有能与核苷酸相结合的游离3′-OH.引物通常是寡聚RNA.此外,DNA复制过程中还需其它酶和蛋白质因子.模板20ArthurKornbergWonthe1959NobelPrizeinMedicineforhisdiscoveryofthemechanisminthebiologicalsynthesisofdeoxyribonucleicacid

(beforeWatsonandCrickwontheirs!)ArthurKornberg21（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-pol

ⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠ22功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。DNA-polⅠ（109kD）功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填23323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Kl24DNA-polⅡ（120kD）

DNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活。它参与DNA损伤的应急状态修复。

DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因发25功能是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ(250kD)功能DNA-polⅢ26DNA聚合酶polⅠpolⅡpolⅢ亚基数目1≥7≥105′→3′聚合酶活性+++3′→5′外切酶活性+++5′→3′外切酶活性+-

-聚合速度(核苷酸/分)1000-1200240015000-60000

持续合成能力3-2001500≥500000功能切除引物,修复修复复制表大肠杆菌3种DNA聚合酶性质比较DNA聚合酶27（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol起始引发，有引28DNA生物合成课件讲义29四、复制中的分子解链及DNA分子拓扑学变化

DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。

四、复制中的分子解链及DNA分子拓扑学变化DNA分子的碱30（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白31解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链引物酶(primase)——复制起始时催化生成RNA引物的酶单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整

解螺旋酶(helicase)32108局部解链后（二）DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)

108局部解链后（二）DNA拓扑异构酶(DNAtop33拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键拓扑异构酶Ⅰ

拓扑异构酶Ⅱ分类拓扑异构酶作用特点拓扑异构酶Ⅰ分类34拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。作用机制

拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结35五、DNA连接酶连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。DNA连接酶(DNAligase)作用方式五、DNA连接酶连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链536HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’目录HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’37DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。功能381、冈崎片段和半不连续复制（1）冈崎片段(Okazakifragment)：

在不连续的后随链DNA合成中形成的DNA短片段，在原核生物有1000～2000核苷酸，真核生物约100～200核苷酸。1968年冈崎发现。（二）双链DNA复制的分子机制1、冈崎片段和半不连续复制（二）双链DNA复制的分子机制39（2）DNA的半不连续复制(semidiscontinuousreplication)：DNA双链复制时，一条链是连续合成的(前导链,leadingstrand),另一条链是不连续合成的(滞后链或后随链,laggingstrand),这种前导链的连续复制和后随链的不连续复制方式称DNA的半不连续复制。（2）DNA的半不连续复制(semidiscontinuou40DNA生物合成课件讲义4135353´5´3´5´解链方向领头链(leadingstrand)后随链(laggingstrand)DNA的半不连续复制3´5´35353´5´3´5´解链方向领头链后随链DNA的42复制叉起点复制叉延伸延伸起点领头链领头链随后链随后链3’5’3’5’DNA的双向复制5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’复制叉起点复制叉延伸延伸起点领头链领头链随后链随后链3’5’432、DNA半不连续复制中的RNA引物（1）前导链和滞后链的合成都需要RNA引物。（2）引物合成酶(DnaG)：是以DNA为模板的RNA聚合酶（合成方向5′→3′）,合成的引物长度为5～10nt。(3)引物RNA的起始和终止的位置受解链酶、引发酶、模板顺序及其二级结构的影响。（4）DNA聚合酶Ⅰ切除前导链及冈崎片段的引物后,填补空缺，由DNA连接酶将切口连接。2、DNA半不连续复制中的RNA引物44总结:

原核生物DNA的复制过程:(以大肠杆菌为例)●双链的解开●起始----RNA引物的合成●DNA链的延伸●终止总结:45B.RNA引物的合成引发体先与DNA起始部位双链结合，通过引物合成酶形成前导链引物后，再沿5′→3′模板链与复制叉同向移动，在移动中断断续续形成冈崎片段的RNA引物。A.双链的解开DNA旋转酶(拓扑异构酶Π)、DNA解链酶、单链结合蛋白协同作用B.RNA引物的合成A.双链的解开46C.DNA链的延伸

在DNApolШ的催化下，以四种dNTP为底物，在RNA引物的3′端以磷酸二酯键连接上脱氧核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时进行领头链和后随链的合成。5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-polC.DNA链的延伸5'3'5'dATPdGTPd47①前导链的延长：DNApolⅢ全酶二聚体的一个亚基与前导链的模板结合而发挥催化作用，与复制叉同向。①前导链的延长：48②滞后链的延长:DNA

pol

Ⅲ全酶二聚体的另一亚基与形成一个环的滞后链的模板结合发挥催化作用。

由于模板形成环,酶向前移动时,滞后链合成片段也沿5′→3′方向生长,与酶催化方向一致。滞后链片段合成接近前方滞后链片段5′末端时,模板被释放,环消失。继续重复,连续进行。②滞后链的延长:49DNA生物合成课件讲义50♦当新形成的冈崎片段延长至一定长度,其3′-OH遇到上一个冈崎片段时即停止合成。♦一旦冈崎片段合成完成，其RNA引物即被除去，通过DNA聚合酶Ⅰ催化合成DNA取而代之，并形成一个切口，此切口由DNA连接酶连接封闭。♦当新形成的冈崎片段延长至一定长度,其351D.复制终止

细菌环状染色体的两个复制叉向前推移，在终止区相遇而停止复制，复制体解体。

这样,以两条亲代DNA链为模板，各自形成一条新的DNA互补链，结果形成了两个DNA双股螺旋分子。

就目前所知，起始阶段是DNA复制中唯一一个可以受调节的阶段，由于受到调节而使得DNA在一个细胞周期中只发生一次复制。D.复制终止就目前所知，起始阶段是DN52DNA生物合成课件讲义53复制的保真性(fidelity)主要依赖3种机制：聚合酶对碱基的选择；

3′→5′方向的外切核酸酶活性起校正作用;复制后错配现象的特异性修复机制。5.DNA聚合酶的“校对”(proofreading)作用

大肠杆菌DNA复制错配率约10-9~10-10。其染色体中有4.5×106bp，平均每1000～10000个细胞经过一次分裂才会插入一个不正确的碱基。复制的保真性(fidelity)主要依赖3种机制54DNA生物合成课件讲义55小结－维持DNA复制准确性的因素：内因:①按碱基配对原则(错配率10-4~10-5)②DNA聚合酶的作用(错配率10-4~10-5)

•对碱基的识别作用----选择正确的碱基参入到引物末端

•对底物的识别作用----先识别引物最后一个碱基是否正确,后识别参入的dNTP是否正确

•校正阅读----3′→5′外切酶的作用③RNA引物最终被切除,提高了复制准确性④复制完成后对错配碱基进行修复的酶系统外因：•四种dNTP要平衡；•Mn2+和Mg2+的比例、浓度（酶活）小结－维持DNA复制准确性的因素：56(一)真核生物的DNA聚合酶:至少5种---

αβγδεDNA-polα－－现认为其功能只是合成引物DNA-pol

δ－－在复制延长中起催化作用DNA-polε－－校对、修复、填补(类似E.coliDNApolI)DNA-polγ－－线粒体DNA合成DNA-polβ－－核DNA修复

四、真核细胞DNA的复制－－（DNA指导下的DNA合成）推测在复制叉上有一个DNApolα,以合成引物;两个DNApolδ,分别合成前导链和滞后链。(一)真核生物的DNA聚合酶:至少5种---αβγδεD57（二）真核生物中DNA的复制特点1、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，多复制子。2、冈崎片段长约200bp.3、真核生物DNA复制速度比原核慢。4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。5、真核生物有多种DNA聚合酶。6、真核生物线性染色体两端有端粒结构，防止染色体间的末端连接。由端粒酶负责新合成链5端RNA引物切除后的填补，亦保持端粒的一定长度。（二）真核生物中DNA的复制特点1、真核生物染色体有多个复制58端粒端粒中心粒图真核生物染色体端粒(telomere)是真核生物线性染色体的两个末端所具有的特殊结构,其共同特点是一条链上富含T、G短序列的多次重复,而其互补链上富含A、C。（三）端粒的复制端粒端粒中心粒图真核生物染色体端粒59端粒主要有两大生理功能：（1）维持染色体结构的完整性，防止染色体被核酸酶降解及染色体间相互融和。（2）防止染色体结构基因在复制时丢失，解决了末端复制的难题。端粒的合成主要依靠端粒酶来催化。端粒主要有两大生理功能：（1）维持染色体结构的完60线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。53355335端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体,它可以其RNA为模板,通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA61DNA生物合成课件讲义62端粒酶的爬行模型（动画演示）端粒酶的爬行模型（动画演示）63五、反转录作用（RNA指导的DNA合成）定义:以RNA为模板,按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA的过程称为反转录(reversetranscription,RT)。该过程由反转录酶催化进行。1970年Temin和Baltimore同时分别从(鸡)劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分离出反转录酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有反转录酶。五、反转录作用（RNA指导的DNA合成）定义:以RNA为模64+RNA+DNA-RNA+DNA-DNA+病毒RNA的反转录过程

（以前病毒形式整合到宿主细胞DNA中而使细胞恶性转化）

单链病毒RNA

RNA-DNA杂交分子双链DNA（前病毒）

反转录酶反转录酶

逆转录酶是多功能酶，兼有3种酶的活性：

RNA指导的DNA聚合酶活性DNA指导的DNA聚合酶活性核糖核酸酶H的活性，专一水解RNA-DNA杂交分子中的RNA，可沿5'

3'和3'

5'两个方向起核酸外切酶的作用。反转录酶也和DNA聚合酶一样,沿5′3′方向合成DNA,并要求短链RNA作引物。+RNA+DNA-RNA+DNA-DNA+病毒RNA的反转录65六、DNA的损伤修复♦DNA的损伤：DNA在复制时产生错配、病毒基因整合，某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，破坏DNA的双螺旋结构，从而影响DNA的复制，并使DNA的转录和翻译也跟着变化，因而表现出异常的特征（生物突变）。♦若DNA的损伤或错配得不到修复，会导致DNA突变。其主要形式：一个或几个碱基被置换插入一个或几个碱基一个或多个碱基对缺失♦DNA的损伤修复——

5种修复途径:错配修复、光复活修复、切除修复、重组修复和诱导修复（亦称暗修复）。六、DNA的损伤修复66错配修复：修复DNA中碱基错配的酶系统。其过程是：识别出不正确的链，切除掉不正确链的部分，然后通过DNA聚合酶和DNA连接酶的作用，合成正确配对的双链DNA。光复活修复：400nm左右的光激活光复活酶，专一分解紫外光照射引起的同一条链上的TT（或CC，CT）二聚体。（包括从单细胞生物到鸟类，而高等哺乳动物无）切除修复：将DNA分子中的受损伤部分切除，以完整的那条链为模板再重新合成。特异内切酶、DNA聚合酶、DNA外切酶、DNA连接酶均参与。（发生在DNA复制前）错配修复：修复DNA中碱基错配的酶系统。其过程是：识别出不正67重组修复（发生在复制后）：复制时，跳过损伤部位，新链产生的缺口由母链弥补，原损伤部位并没有切除但在后代逐渐稀释。诱导修复：造成DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应,称为应急反应(SOSresponse)。此过程诱导产生切除修复和重组修复中的关键蛋白和酶，同时产生无校对功能的DNA聚合酶。所以会有2种结果：修复或变异（进化）。重组修复（发生在复制后）：复制时，跳过损伤部位，新链产生的缺68相邻的胸腺嘧啶紫外线照射环丁烷胸腺嘧啶二聚体紫外线诱导嘧啶二聚体形成相邻的胸腺嘧啶紫外线照射环丁烷胸腺嘧啶二聚体紫外线诱导嘧啶二69DNA生物合成课件讲义70DNA生物合成课件讲义71DNA生物合成课件讲义72萤火虫的荧光素基因在烟草中表达人生长素基因被导入并整合到右边小鼠的基因组番茄工程植株具有抗昆虫幼虫的能力萤火虫的荧光素基因人生长素基因被导入并整合到右边小鼠73§核酸的生物合成青岛农业大学生命科学学院生物化学与分子生物学教研室§核酸的生物合成青岛农业大学生命科学学院74复制的方式——半保留复制(semi-conservativereplication)复制的高保真性(highfidelity)双向复制(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication)复制的方式75一.DNA的半保留复制复制时,每一条DNA链在新链合成中充当模板，按碱基配对方式形成两个新的DNA分子，每个分子都含有一条新链和一条旧链，这种复制方式即半保留复制(semiconservativereplication)。Watson和Crick开创性的论文，对DNA双螺旋的描述以这样一段陈述结尾：“不出我们的意料，我们所假设的特异性配对立即提示一种遗传物质可能的复制机制。”

一.DNA的半保留复制复制时,每一条DNA76半保留复制亲代第一代第二代半保留复制的实验证据

1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA，首先证明了DNA的半保留复制。半保留复制亲代第一代第二代半保留复制的实验证据77重轻杂和DNA杂和DNA重轻杂和DNA杂和DNA78新链旧链DNA的半保留复制的生物学意义：DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。（但DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质。）新链旧链DNA的半保留复制的生物学意义：DNA的半保留复制表79二.复制的起点和方向

复制是一个高度协调的过程，母链解链和复制同时进行。（一）概念●复制子(replicon)：基因组能独立进行复制的单位。●起点(origin)：控制复制起始，是含有100～200个碱基对的一段DNA。细胞内存在着能识别起点的特殊蛋白质(大肠杆菌中称为DnaA蛋白)。二.复制的起点和方向复制是一个高度协调的过80●终点(terminus)：终止复制的序列位点.●复制叉(replicationfork)：复制开始后由于DNA双链解开，在两股单链上进行复制，形成在显微镜下可看到的叉状结构。●终点(terminus)：终止复制的序列位点.81DNA生物合成课件讲义82原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。复制中的放射自显影图象原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链83A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABCA.环状双链DNA及复制起始点oriterA84真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。855’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制子3’5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’86原核生物：只有一个复制子真核生物：多个复制子，多个起点，形成多个“复制眼”或“复制泡”原核生物：只有一个复制子87（二）起始点和方向1.原核生物和真核生物复制都是在DNA分子特定的位置起始的，如大肠杆菌起始点有固定的保守顺序GATC和TTATCCACA，多次出现，可被酶识别。2.方向：大多是双向、对称复制,也有单向或不对称的。3.速度：原核生物复制叉移动快(约105bp/min);真核生物复制叉移动慢(约5×102～5×103bp/min)（二）起始点和方向2.方向：大多是双向、对称复88双向复制复制叉起点起点单向复制双向复制复制叉起点起点单向复制89复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）90三.原核细胞DNA的复制(DNA指导下的DNA合成)（一）DNA聚合酶(DNApolymerase,DNA-pol)DNA聚合酶是一种催化依赖模板的由脱氧核苷三磷酸前体合成DNA的酶。1956年Arthurkornberg等首先从大肠杆菌中发现DNA聚合酶，其后在广泛不同的生物中都找到有这种酶。三.原核细胞DNA的复制(DNA指导下的DNA合成)（一）91DNA聚合酶的反应特点：♦

4种dNTP底物：(dATPdGTPdCTPdTTP)；♦接受模板指导:解开成单链的DNA母链；♦需引物提供3′-OH；♦新链生长方向：5′→3′；♦产物DNA性质与模板相同。DNA聚合酶的反应特点：92

此外,DNA复制过程中还需其它酶和蛋白质因子.模板DNA链引物新加入的dNTP脱氧核糖亲核攻击5′3′生长的DNA链*引物(primer)是一和模板链互补的线性片段,其上带有能与核苷酸相结合的游离3′-OH.引物通常是寡聚RNA.此外,DNA复制过程中还需其它酶和蛋白质因子.模板93ArthurKornbergWonthe1959NobelPrizeinMedicineforhisdiscoveryofthemechanisminthebiologicalsynthesisofdeoxyribonucleicacid

(beforeWatsonandCrickwontheirs!)ArthurKornberg94（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-pol

ⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠ95功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。DNA-polⅠ（109kD）功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填96323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Kl97DNA-polⅡ（120kD）

DNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活。它参与DNA损伤的应急状态修复。

DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因发98功能是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ(250kD)功能DNA-polⅢ99DNA聚合酶polⅠpolⅡpolⅢ亚基数目1≥7≥105′→3′聚合酶活性+++3′→5′外切酶活性+++5′→3′外切酶活性+-

-聚合速度(核苷酸/分)1000-1200240015000-60000

持续合成能力3-2001500≥500000功能切除引物,修复修复复制表大肠杆菌3种DNA聚合酶性质比较DNA聚合酶100（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol起始引发，有引101DNA生物合成课件讲义102四、复制中的分子解链及DNA分子拓扑学变化

DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。

四、复制中的分子解链及DNA分子拓扑学变化DNA分子的碱103（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白104解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链引物酶(primase)——复制起始时催化生成RNA引物的酶单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整

解螺旋酶(helicase)105108局部解链后（二）DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)

108局部解链后（二）DNA拓扑异构酶(DNAtop106拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键拓扑异构酶Ⅰ

拓扑异构酶Ⅱ分类拓扑异构酶作用特点拓扑异构酶Ⅰ分类107拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。作用机制

拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结108五、DNA连接酶连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。DNA连接酶(DNAligase)作用方式五、DNA连接酶连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5109HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’目录HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’110DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。功能1111、冈崎片段和半不连续复制（1）冈崎片段(Okazakifragment)：

在不连续的后随链DNA合成中形成的DNA短片段，在原核生物有1000～2000核苷酸，真核生物约100～200核苷酸。1968年冈崎发现。（二）双链DNA复制的分子机制1、冈崎片段和半不连续复制（二）双链DNA复制的分子机制112（2）DNA的半不连续复制(semidiscontinuousreplication)：DNA双链复制时，一条链是连续合成的(前导链,leadingstrand),另一条链是不连续合成的(滞后链或后随链,laggingstrand),这种前导链的连续复制和后随链的不连续复制方式称DNA的半不连续复制。（2）DNA的半不连续复制(semidiscontinuou113DNA生物合成课件讲义11435353´5´3´5´解链方向领头链(leadingstrand)后随链(laggingstrand)DNA的半不连续复制3´5´35353´5´3´5´解链方向领头链后随链DNA的115复制叉起点复制叉延伸延伸起点领头链领头链随后链随后链3’5’3’5’DNA的双向复制5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’复制叉起点复制叉延伸延伸起点领头链领头链随后链随后链3’5’1162、DNA半不连续复制中的RNA引物（1）前导链和滞后链的合成都需要RNA引物。（2）引物合成酶(DnaG)：是以DNA为模板的RNA聚合酶（合成方向5′→3′）,合成的引物长度为5～10nt。(3)引物RNA的起始和终止的位置受解链酶、引发酶、模板顺序及其二级结构的影响。（4）DNA聚合酶Ⅰ切除前导链及冈崎片段的引物后,填补空缺，由DNA连接酶将切口连接。2、DNA半不连续复制中的RNA引物117总结:

原核生物DNA的复制过程:(以大肠杆菌为例)●双链的解开●起始----RNA引物的合成●DNA链的延伸●终止总结:118B.RNA引物的合成引发体先与DNA起始部位双链结合，通过引物合成酶形成前导链引物后，再沿5′→3′模板链与复制叉同向移动，在移动中断断续续形成冈崎片段的RNA引物。A.双链的解开DNA旋转酶(拓扑异构酶Π)、DNA解链酶、单链结合蛋白协同作用B.RNA引物的合成A.双链的解开119C.DNA链的延伸

在DNApolШ的催化下，以四种dNTP为底物，在RNA引物的3′端以磷酸二酯键连接上脱氧核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时进行领头链和后随链的合成。5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-polC.DNA链的延伸5'3'5'dATPdGTPd120①前导链的延长：DNApolⅢ全酶二聚体的一个亚基与前导链的模板结合而发挥催化作用，与复制叉同向。①前导链的延长：121②滞后链的延长:DNA

pol

Ⅲ全酶二聚体的另一亚基与形成一个环的滞后链的模板结合发挥催化作用。

由于模板形成环,酶向前移动时,滞后链合成片段也沿5′→3′方向生长,与酶催化方向一致。滞后链片段合成接近前方滞后链片段5′末端时,模板被释放,环消失。继续重复,连续进行。②滞后链的延长:122DNA生物合成课件讲义123♦当新形成的冈崎片段延长至一定长度,其3′-OH遇到上一个冈崎片段时即停止合成。♦一旦冈崎片段合成完成，其RNA引物即被除去，通过DNA聚合酶Ⅰ催化合成DNA取而代之，并形成一个切口，此切口由DNA连接酶连接封闭。♦当新形成的冈崎片段延长至一定长度,其3124D.复制终止

细菌环状染色体的两个复制叉向前推移，在终止区相遇而停止复制，复制体解体。

这样,以两条亲代DNA链为模板，各自形成一条新的DNA互补链，结果形成了两个DNA双股螺旋分子。

就目前所知，起始阶段是DNA复制中唯一一个可以受调节的阶段，由于受到调节而使得DNA在一个细胞周期中只发生一次复制。D.复制终止就目前所知，起始阶段是DN125DNA生物合成课件讲义126复制的保真性(fidelity)主要依赖3种机制：聚合酶对碱基的选择；

3′→5′方向的外切核酸酶活性起校正作用;复制后错配现象的特异性修复机制。5.DNA聚合酶的“校对”(proofreading)作用

大肠杆菌DNA复制错配率约10-9~10-10。其染色体中有4.5×106bp，平均每1000～10000个细胞经过一次分裂才会插入一个不正确的碱基。复制的保真性(fidelity)主要依赖3种机制127DNA生物合成课件讲义128小结－维持DNA复制准确性的因素：内因:①按碱基配对原则(错配率10-4~10-5)②DNA聚合酶的作用(错配率10-4~10-5)

•对碱基的识别作用----选择正确的碱基参入到引物末端

•对底物的识别作用----先识别引物最后一个碱基是否正确,后识别参入的dNTP是否正确

•校正阅读----3′→5′外切酶的作用③RNA引物最终被切除,提高了复制准确性④复制完成后对错配碱基进行修复的酶系统外因：•四种dNTP要平衡；•Mn2+和Mg2+的比例、浓度（酶活）小结－维持DNA复制准确性的因素：129(一)真核生物的DNA聚合酶:至少5种---

αβγδεDNA-polα－－现认为其功能只是合成引物DNA-pol

δ－－在复制延长中起催化作用DNA-polε－－校对、修复、填补(类似E.coliDNApolI)DNA-polγ－－线粒体DNA合成DNA-polβ－－核DNA修复

四、真核细胞DNA的复制－－（DNA指导下的DNA合成）推测在复制叉上有一个DNApolα,以合成引物;两个DNApolδ,分别合成前导链和滞后链。(一)真核生物的DNA聚合酶:至少5种---αβγδεD130（二）真核生物中DNA的复制特点1、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，多复制子。2、冈崎片段长约200bp.3、真核生物DNA复制速度比原核慢。4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。5、真核生物有多种DNA聚合酶。6、真核生物线性染色体两端有端粒结构，防止染色体间的末端连接。由端粒酶负责新合成链5端RNA引物切除后的填补，亦保持端粒的一定长度。（二）真核生物中DNA的复制特点1、真核生物染色体有多个复制131端粒端粒