地中海贫血的分子基础和产前诊断-徐湘民课件

地中海贫血的分子基础和产前诊断徐湘民南方医科大学基础医学院SchoolofBasicMedicalSciences,SouthernMedicalUniversity北海，2013年8月23-25日遗传性血红蛋白病Inheriteddisordersofhemoglobin

异常血红蛋白

Abnormalhemoglobin,Structuralvariants

地中海贫血(地贫)

Thalassemias-thalassemia

-thalassemia

遗传性持续性胎儿血红蛋白

Hereditarypersistenceoffetalhemoglobin(HPFH)血红蛋白病是世界上最常见的出生缺陷之一全球每年约有790万出生缺陷患儿出生5中常见的疾病占7000种出生缺陷的25%血红蛋白病的发病率位于第三位204060801001200－－－－－－－－－－全球5种常见的出生缺陷全球血红蛋白病人群负荷Blood,2011;WHOStatistics,2012.中国异常血红蛋白调查ZengYT,HuangSZ.JMedGenet,1987.中国地中海贫血调查ZengYT,HuangSZ.JMedGenet,1987.ZengYT,HuangSZ.JMedGenet,1987.中国地中海贫血调查8.53%2.54%地贫地贫正常人群88.93％%%11种突变12种突变地贫携带者约1000万广东地中海贫血流行病学调查JClinPathol,2004.

正常人群75.86%17.55%-地贫6.43%地贫地贫0.16%正常人群75.86％地贫17.55%%%9种突变13种突变广西地中海贫血流行病学调查地贫携带者约1000万ClinGenet,2010.中国南方血红蛋白病人群负荷和地中海贫的分子基础

常染色体隐性遗传病致病基因：地贫-珠蛋白基因（16p13.3）地贫-珠蛋白基因（11p15.3）突变纯合子：重型地贫-致死中间型地贫-致残病理学基础：

/链比例失衡和地贫的病理学机制和临床分类-珠蛋白基因表达

-地中海贫血临床综合征正常正常

-地中海贫血特征-地中海贫血特征HbH病中间型-地中海贫血Bart’s胎儿水肿综合征重型-地中海贫血

-地中海贫血临床综合征

-珠蛋白基因表达珠蛋白链不平衡16p13.311p15.3地中海贫血的临床特征小细胞低色素性溶血型贫血(中、重度)黄疸肝脾肿大(脾大明显)骨髓扩增发育迟缓合并感染Bart’s水肿胎(地贫,宫内或出生后半小时内死亡)地贫血象：红细胞着色不足、异形红细胞和骨髓成红血细胞增多症12345NormalAA2AEBart’sAFHA+-500V,25min血红蛋白电泳图谱1.正常人Hb2.轻型地贫3.异常HbE杂合子4.新生儿HbBart’s(4,

地贫标准型）5.HbH中间型地贫的临床特征轻度黄疸肝脾肿大(脾大明显)骨髓扩增合并感染不需进行常规输血治疗血红蛋白水平维持在60-100g/L水平发病年龄在2岁以后,或成年期发病重型地贫重型地贫中间型地贫地贫是严重致死、致残性遗传性血液病地中海贫血的防治对策

重症地贫患儿的出生是世界公认的公共卫生问题

通过产前诊断阻止重症患儿出生是首选预防措施

WHO优先推荐在发展中国家实施预防的遗传性疾病

预防地贫是中国南方高发区减少出生缺陷的战略需求

地中海贫血的研究策略建立一系列诊断标准和诊断技术遗传流行病学调查大人群监控和预防用于基因分型用于产前诊断指导制定计划和地贫发生的分子遗传学机制

-珠蛋白基因缺失

中间型地贫:复杂变异

-珠蛋白基因点突变

和地贫发生的分子遗传学机制

-珠蛋白基因缺失

中间型地贫:复杂变异

-珠蛋白基因点突变

2

1

2

1

3’HVRinterξHVR5’3’4个功能性的α基因3个功能性的α基因2个功能性的α基因0个功能性的α基因1个功能性的α基因正常静止型α地贫轻型α地贫HbH病HbBart's胎儿水肿综合征地中海贫血表型和基因型的关系12种见于中国人群的导致2/1珠蛋白基因表达降低的突变

CD59错义突变小缺失或插入终止密码突变移码突变

IVSIIVSIIUTRUTR5’3’CD13CD31CD125CD122CD142CD44–45CD49CD30CD78CD74CD11821EXONIIEXONI

EXONIII地中海贫血预防控制操作指南.人民军医出版社,2011.

中国南方人群不同基因型HbH病的分布UnpublishedData,2012.//–3.7/–4.2WS/CS/

QS/––SEA/––THAI///–3.7/–4.2WS/CS/

QS/––SEA/––THAI/中国人主要-珠蛋白基因型与血液学表型的关系UnpublishedData,2012.和地贫发生的分子遗传学机制

-珠蛋白基因缺失中间型地贫:复杂变异

-珠蛋白基因点突变

和地贫发生的分子遗传学机制

-珠蛋白基因缺失

中间型地贫:复杂变异

-珠蛋白基因点突变

50种见于中国南方的导致珠蛋白基因表达降低的突变

地中海贫血预防控制操作指南.人民军医出版社,2011.

导致中国人群中间型的β+地贫突变6种引起地中海贫血的基因缺失地中海贫血预防控制操作指南.人民军医出版社,2011.

和地贫发生的分子遗传学机制

-珠蛋白基因缺失

中间型地贫:复杂变异

-珠蛋白基因点突变

和地贫发生的分子遗传学机制

-珠蛋白基因缺失

中间型地贫:复杂变异

-珠蛋白基因点突变

产前基因诊断：地贫预防的技术基础

人群携带者筛查发现高风险家庭

基于DNA分析的胎儿基因型诊断胎儿取样

家系分析产前基因诊断：地贫预防的技术基础

人群携带者筛查发现高风险家庭

基于DNA分析的胎儿基因型诊断胎儿取样

家系分析

用于携带者检测的表型分析方法

全血细胞计数MCV(<80fL)MCH(<27pg)

血红蛋白分析(电泳/HPLC)

HbA2()or()HbF()HbBart’s()HbCS()HbE()免疫学定性检测

东南亚缺失型地贫链(阳性)地中海血贫携带者筛查及产前诊断流程被检对象（婚前或孕早、中期）血液学分析（MCV，HbA2%

）排除地贫地贫携带者遗传咨询，配偶检查地贫携带者排除地贫遗传咨询双亲基因分析胎儿产前诊断终止妊娠血液学分析（MCV，HbA2%）？产前基因诊断：地贫预防的技术基础

人群携带者筛查发现高风险家庭

基于DNA分析的胎儿基因型诊断胎儿取样

家系分析产前基因诊断：地贫预防的技术基础

人群携带者筛查发现高风险家庭

基于DNA分析的胎儿基因型诊断

胎儿取样

家系分析羊膜穿刺(amniocentesis)抽取胎儿样品示意图

Gap-PCR技术用于-地贫的产前诊断MNPBFaMoFeFaMoFe

FaMoFe

NormalHeterozygoteHomozygoteFamily1Family2Family3NormalMutant

家系分析：RDB用于-地贫的产前诊断-29-28cd17cd261-11-5cd27/28cd41/42正常

突变

NMNMNM

cd43cd71/72654基因型父亲CDs41-42(CTTT)/N

母亲CDs17(AT)/N胎儿CDs41-42/CDs17(AT)正常对照

N/N基于DNA分析的检测策略

DNA分析需在血液学表型结果的指导下进行

DNA分析需优先针对种族特异性常见的突变血液学分析指导血红蛋白病诊断的一般原则用于和地贫临床基因分型的实验室流程Gap-PCR/MLPA

(1)临床样品

-地中海贫血-地中海贫血Gap-PCR/MLPA(2)RDB/PMCA(1)RDB/PMCA(2)FBC/HbAnalysisHbCSetcHbF>5%中国南方发现的5种占人群90%的常见地中海贫血基因突变地中海贫血的DNA诊断

-地贫:基因缺失分析技术-地贫:基因点突变分析技术

ReverseDotBlot（RDB）:

反向点杂交

probemeltingcurve-basedgenotypingassay

（PMCA）:

基于探针熔解曲线的基因分型

Gap-PCR:缺口PCR

MultiplexLigation-dependentProbeAmplification（MLPA）:多重连接探针扩增检测基因拷贝数的荧光定量PCR目前已获准或正在申报产品注册证的检测中国人地贫突变的分子诊断技术

3种缺失型地贫检测试剂盒：单管多重gap-PCR法

17种地贫突变检测试剂盒：反向点杂交法

多位点缺失型地贫检测试剂盒：PCR荧光探针法

25种地贫突变检测试剂盒：荧光PCR熔解曲线法--HW--THAI--FIL

--SEA--11Kb

4.23.72ψξ11

ξ3’HVRξ’HVRψ1ψ210kb0kb20kb

30kb

40kb50kb5’3’检测基因拷贝数的荧光定量PCR拷贝数相对定量诊断模型

1基因2个拷贝

看家基因2个拷贝

1基因1个拷贝

看家基因2个拷贝

1基因0个拷贝

看家基因2个拷贝Ct值△Ct33334No01－482844848无扩增3个循环3个循环3个循环4个循环161616160483个循环16PCR扩增三个靶基因拷贝数定量分析结果JMolDiagn.2013.

864例样品定量诊断特异性评价--SEA/,-3.7/-4.2/等基因分型--SEA,-3.7,-4.2

等单倍型分析珠蛋白基因拷贝数-地贫分子诊断:临床表型与基因分型基因缺失基因缺失基因缺失Gap-PCR定性检测基因缺失待检人基因组DNA-地贫定量与定性检测的比较基因缺失基因缺失基因重复PMCA检测原理及流程图JMolDiagn,2011.

25种地贫突变熔解曲线图谱与传统RDB检测方法的比较SamplesVariantIdentifiedPCR/meltinganalysisHybridizationMembraneWashingPCRRDBMeltProSignalDevelopmentPCRDirectSequencingPCRClean-UpSequencingPCRCapillaryElectrophoresis(260min)VariantIdentifiedVariantIdentified(370min)(160min)30min3reactions100min15min100min120min45min120min2reactions160min1reaction100min

和地中海贫血的预防计划

目前基于人群筛查的预防模式

扩展家系筛查计划基于医院水平的预防计划基于社区或行政区的预防计划人群干预可以降低出生缺陷发生率

世界卫生组织的出生缺陷“三级预防”策略

一级：婚前检查二级：产前筛查和产前诊断三级：患儿治疗

孕前和孕期干预是我国出生缺陷预防的重点

探索基于社区的出生缺陷预防模式

斗门区

金湾区

香洲区

统一调度

质量控制

转诊病例确诊

高风险对象建档

产前诊断一级技术中心

宣传教育

携带者筛查

病例转诊

遗传咨询

随访二级检测站斗门市妇幼保健院唐家镇医院香州区妇幼保健院珠海市妇幼保健院横琴医院金湾区妇幼保健院珠海市地中