核酸含量测定-定磷法课件

核酸含量测定定磷法1核酸含量测定定磷法1核酸定量测定常见的方法1.定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸含量，反应灵敏。2.紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。3.地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热，降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异性差，戊糖均有此反应。4.二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω-羟-γ-酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯糖外其他糖类无此反应。2核酸定量测定常见的方法1.定磷法：将核酸消化，测定其无机磷定磷法的原理首先将核酸样品用硫酸消化成无机磷，利用定磷试剂测定无机磷量。反应式为：(NH4)MoO4+H2SO4H2MoO4+(NH4)2SO4H3PO4+12H2MoO4H3P(Mo3O10)4+12H2O

H3P(Mo3O10)4Mo2O3•

MoO3（钼蓝）Vit•C3定磷法的原理首先将核酸样品用硫酸消化成无机

还原产物钼蓝在波长660nm测定吸光值，当无机磷含量在1—25μg范围内，光吸收和含磷量成正比。

RNA的含磷量为9.5%，即1μgRNA磷相当于10.5μgRNA。DNA的含磷量平均为9.9%。4还原产物钼蓝在波长660nm测定吸光值，当无试剂酵母RNA样品溶液：2000μg/mL标准磷原液：含磷量为1000μg/mL标准磷溶液：含磷量为10μg/mL，每组用干试管取15mL定磷试剂：含硫酸、钼酸铵、Vit.C，浅黄色，如果变绿则不能使用,每组用100mL烧杯取70mL5试剂酵母RNA样品溶液：2000μg/mL5实验步骤1.核酸样品用硫酸消化，将有机磷转化成无机磷；2.制定定磷标准曲线；3.测定回收率和样品总磷量。6实验步骤1.核酸样品用硫酸消化，将有机磷转化成无机磷；61.样品消化（每两组或三组做一份）消化管123RNA/mL010标准磷原液/mL001dH2O/mL1005mol/LH2SO4/mL222消煮炉中消化2—6h至溶液无色透明，冷却dH2O/mL111沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却用dH2O定容/mL505050混匀71.样品消化（每两组或三组做一份）消化管123RNA/m2.定磷标准曲线的制定（每人做一份）

每人取18支试管，按照下表平行操作：

1

234

5

6标准磷溶液/mL00.10.20.30.40.5dH2O/mL1.51.41.31.21.11.0定磷试剂/mL1.51.51.51.51.51.5用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟用去离子水作为空白，660nm测定吸光值A660(1)A660(2)A660平均值A660平均值—空白082.定磷标准曲线的制定（每人做一份）

每人取

3.测定总磷量和回收率（与2同时进行）7（空白）

8（样品）9（标准）定容溶液/mL1.51.50.15dH2O/mL001.35定磷试剂/mL1.51.51.5用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟A660(1)A660(2)A660平均值A660平均值—空白093.测定总磷量和回收率（与2同时进行）7（空白）

8（样数据处理关于空白：1—6号管用于绘制定磷标准曲线，1号管作为空白。7—9号管用于样品及回收率的测定，7号管作为空白。以每管含磷量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标画标准曲线，直线应过原点。在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量(μg)。10数据处理关于空白：10计算回收率：

(2)计算样品总磷量：

(3)计算RNA量：

(4)样品RNA含量：11计算回收率：11操作注意事项1.每人独立操作，不允许两人穿插取样；2.要求试剂及所有器皿清洁，不含磷；3.每管加样和测定均要求平行操作；4.消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样；5.各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。6.漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向下用力。7.测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定，不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。

12操作注意事项1.每人独立操作，不允许两人穿插取样；12思考题1.回收率的意义；2.实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的酸度对测定结果的影响。13思考题1.回收率的意义；13实验结束将试管洗净，斜插在试管架上，放在台面上。将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿中。将实验台面擦干净。14实验结束将试管洗净，斜插在试管架上，放在台面上。14核酸含量测定定磷法15核酸含量测定定磷法1核酸定量测定常见的方法1.定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸含量，反应灵敏。2.紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。3.地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热，降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异性差，戊糖均有此反应。4.二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω-羟-γ-酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯糖外其他糖类无此反应。16核酸定量测定常见的方法1.定磷法：将核酸消化，测定其无机磷定磷法的原理首先将核酸样品用硫酸消化成无机磷，利用定磷试剂测定无机磷量。反应式为：(NH4)MoO4+H2SO4H2MoO4+(NH4)2SO4H3PO4+12H2MoO4H3P(Mo3O10)4+12H2O

H3P(Mo3O10)4Mo2O3•

MoO3（钼蓝）Vit•C17定磷法的原理首先将核酸样品用硫酸消化成无机

还原产物钼蓝在波长660nm测定吸光值，当无机磷含量在1—25μg范围内，光吸收和含磷量成正比。

RNA的含磷量为9.5%，即1μgRNA磷相当于10.5μgRNA。DNA的含磷量平均为9.9%。18还原产物钼蓝在波长660nm测定吸光值，当无试剂酵母RNA样品溶液：2000μg/mL标准磷原液：含磷量为1000μg/mL标准磷溶液：含磷量为10μg/mL，每组用干试管取15mL定磷试剂：含硫酸、钼酸铵、Vit.C，浅黄色，如果变绿则不能使用,每组用100mL烧杯取70mL19试剂酵母RNA样品溶液：2000μg/mL5实验步骤1.核酸样品用硫酸消化，将有机磷转化成无机磷；2.制定定磷标准曲线；3.测定回收率和样品总磷量。20实验步骤1.核酸样品用硫酸消化，将有机磷转化成无机磷；61.样品消化（每两组或三组做一份）消化管123RNA/mL010标准磷原液/mL001dH2O/mL1005mol/LH2SO4/mL222消煮炉中消化2—6h至溶液无色透明，冷却dH2O/mL111沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却用dH2O定容/mL505050混匀211.样品消化（每两组或三组做一份）消化管123RNA/m2.定磷标准曲线的制定（每人做一份）

每人取18支试管，按照下表平行操作：

1

234

5

6标准磷溶液/mL00.10.20.30.40.5dH2O/mL1.51.41.31.21.11.0定磷试剂/mL1.51.51.51.51.51.5用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟用去离子水作为空白，660nm测定吸光值A660(1)A660(2)A660平均值A660平均值—空白0222.定磷标准曲线的制定（每人做一份）

每人取

3.测定总磷量和回收率（与2同时进行）7（空白）

8（样品）9（标准）定容溶液/mL1.51.50.15dH2O/mL001.35定磷试剂/mL1.51.51.5用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟A660(1)A660(2)A660平均值A660平均值—空白0233.测定总磷量和回收率（与2同时进行）7（空白）

8（样数据处理关于空白：1—6号管用于绘制定磷标准曲线，1号管作为空白。7—9号管用于样品及回收率的测定，7号管作为空白。以每管含磷量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标画标准曲线，直线应过原点。在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量(μg)。24数据处理关于空白：10计算回收率：

(2)计算样品总磷量：

(3)计算RNA量：

(4)样品RNA含量：25计算回收率：11操作注意事项1.每人独立操作，不允许两人穿插取样；2.要求试剂及所有器皿清洁，不含磷；3.每管加样和测定均要求平行操作；4.消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样；5.各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。6.漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向下用力。7.测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定，不用润洗，切忌