生化试验课件实验八：质粒提取与琼脂糖凝胶电泳检测

实验八质粒提取与电泳ExtractionandIdentificationofRecombinantPlasmid刘向华南京医科大学生化与分子生物学系NanjingmedicaluniversityDepartmentofbiochemistryandmolecularbiology实验八刘向华1实验目的1、学习碱裂解法提取质粒的原理2、学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法3、掌握质粒提取及鉴定的基本操作实验目的1、学习碱裂解法提取质粒的原理2实验原理质粒(Plasmid)

是细菌染色体外的遗传物质，为环形闭合的双股DNA。质粒具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。

在基因工程中质粒常被用做基因的载体。

实验原理质粒(Plasmid)3DNA琼脂糖凝胶电泳：电荷效应与分子筛效应核酸从负极向正极泳动，小分子泳动速度较快质粒DNA较染色体DNA小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点。pH调至中性，变性的质粒DNA恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，与蛋白质一起沉淀。碱变性条件下,染色体DNA双螺旋解开而变性，而质粒DNA部分解开,双链不会完全分离。DNA琼脂糖凝胶电泳：质粒DNA较染色体DN4实验步骤取1.5ml菌液，9000rpm离心30秒，尽可能的倒干上清。用250μl溶液P1重悬菌体沉淀，枪头反复抽吸至菌体彻底悬浮。P1：葡萄糖：制造低渗环境，增加细菌细胞膜的通透性；增加溶液的粘稠度，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉底。EDTA：螯合核酸酶加250μl溶液P2，温和地上下翻转10次使菌体充分裂解至清亮。P2：NaOH/SDS溶液，是最佳的溶解细胞的试剂。NaOH使DNA变性，SDS使蛋白质变性。染色体与蛋白质缠绕。加400μl溶液P3，立即温和地上下翻转10次，放置5min。13000rpm离心10min，小心取上清。P3：醋酸/醋酸钾溶液，使溶液pH值恢复接近中性。此时质粒DNA复性，而染色体DNA难以复性。SDS遇到K+变成十二烷基硫酸钾，不溶于水，连同结合的蛋白质和缠绕其上的染色体DNA共同沉淀。实验步骤取1.5ml菌液，9000rpm离心30秒，尽5加500μl去蛋白液PE，13000rpm离心60sec，弃滤液。加500μl漂洗液WB，13000rpm离心60sec，弃滤液。（重复一遍）取出吸附柱，放入干净离心管中，在吸附膜中间部位加40μl洗脱缓冲液EB，放置1min，13000rpm离心1min洗脱DNA，-20℃保存。空柱13000rpm离心2min。敞口放置3min，除去残留乙醇。将上清液加入吸附柱中，13000rpm离心1min，弃滤液。注意：吸附柱使用前需先处理。将吸附柱置于收集管上，加500μl溶液P4，13000rpm离心1min，弃滤液。P4：缓冲液，湿润、平衡吸附膜加500μl去蛋白液PE，13000rpm离心60sec，弃6加250μl溶液P2，温和地上下翻转6~10次使菌体充分裂解，至溶液变清亮。取1.5ml菌液，9000rpm离心30秒，尽可能的倒干上清。用250μl溶液P1重悬菌体沉淀，枪头反复抽吸至菌体彻底悬浮。加400μl溶液P3，立即温和地上下翻转6~10次，放置5min。13000rpm离心10min，小心取上清。吸附柱置于收集管上，加500μl溶液P4，13000rpm离心1min，弃滤液。加500μl去蛋白液PE，13000rpm离心30~60sec，弃滤液。加500μl漂洗液WB，13000rpm离心30~60sec，弃滤液。（重复一次）取出吸附柱，放入干净离心管中，在吸附膜中间部位加40μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65~70℃水浴中加热效果更好），放置1min，13000rpm离心1min洗脱DNA，-20℃保存。空柱13000rpm离心2min。放置3~5min，除去残留乙醇。将上清液加入吸附柱中，13000rpm离心1min，弃滤液。加250μl溶液P2，温和地上下翻转6~10次使菌体充分裂解7琼脂糖凝胶电泳样品：10μl质粒样品+2μl上样缓冲液，混匀电泳：90~120mA，电泳20~40分钟配胶：琼脂糖凝胶粉，溶于TBE缓冲液中，配成1%~1.2%的琼脂糖凝胶上样：将样品用微量移液器加入凝胶孔中琼脂糖凝胶电泳样品：10μl质粒样品+2μl上样缓冲82000bp1000bp750bp500bp250bp100bpMarkerPEP－＋实验结果2000bp1000bp750bp500bp250bp109负极正极负极正极10注意事项1、注意无菌操作，避免细菌污染质粒；2、琼脂糖凝胶的配制、使用过程中用到溴化乙锭(EB)是强诱变剂，具有高致癌性，注意自我防护；3、所有接触到琼脂糖凝胶的器械均须专用；4、制备质粒过程中，操作必须缓和，不可剧烈荡，避免机械剪切力对DNA的断裂作用。注意事项1、注意无菌操作，避免细菌污染质粒；11超净工作台超净工作台12开始实验开始实验13实验八质粒提取与电泳ExtractionandIdentificationofRecombinantPlasmid刘向华南京医科大学生化与分子生物学系NanjingmedicaluniversityDepartmentofbiochemistryandmolecularbiology实验八刘向华14实验目的1、学习碱裂解法提取质粒的原理2、学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法3、掌握质粒提取及鉴定的基本操作实验目的1、学习碱裂解法提取质粒的原理15实验原理质粒(Plasmid)

是细菌染色体外的遗传物质，为环形闭合的双股DNA。质粒具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。

在基因工程中质粒常被用做基因的载体。

实验原理质粒(Plasmid)16DNA琼脂糖凝胶电泳：电荷效应与分子筛效应核酸从负极向正极泳动，小分子泳动速度较快质粒DNA较染色体DNA小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点。pH调至中性，变性的质粒DNA恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，与蛋白质一起沉淀。碱变性条件下,染色体DNA双螺旋解开而变性，而质粒DNA部分解开,双链不会完全分离。DNA琼脂糖凝胶电泳：质粒DNA较染色体DN17实验步骤取1.5ml菌液，9000rpm离心30秒，尽可能的倒干上清。用250μl溶液P1重悬菌体沉淀，枪头反复抽吸至菌体彻底悬浮。P1：葡萄糖：制造低渗环境，增加细菌细胞膜的通透性；增加溶液的粘稠度，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉底。EDTA：螯合核酸酶加250μl溶液P2，温和地上下翻转10次使菌体充分裂解至清亮。P2：NaOH/SDS溶液，是最佳的溶解细胞的试剂。NaOH使DNA变性，SDS使蛋白质变性。染色体与蛋白质缠绕。加400μl溶液P3，立即温和地上下翻转10次，放置5min。13000rpm离心10min，小心取上清。P3：醋酸/醋酸钾溶液，使溶液pH值恢复接近中性。此时质粒DNA复性，而染色体DNA难以复性。SDS遇到K+变成十二烷基硫酸钾，不溶于水，连同结合的蛋白质和缠绕其上的染色体DNA共同沉淀。实验步骤取1.5ml菌液，9000rpm离心30秒，尽18加500μl去蛋白液PE，13000rpm离心60sec，弃滤液。加500μl漂洗液WB，13000rpm离心60sec，弃滤液。（重复一遍）取出吸附柱，放入干净离心管中，在吸附膜中间部位加40μl洗脱缓冲液EB，放置1min，13000rpm离心1min洗脱DNA，-20℃保存。空柱13000rpm离心2min。敞口放置3min，除去残留乙醇。将上清液加入吸附柱中，13000rpm离心1min，弃滤液。注意：吸附柱使用前需先处理。将吸附柱置于收集管上，加500μl溶液P4，13000rpm离心1min，弃滤液。P4：缓冲液，湿润、平衡吸附膜加500μl去蛋白液PE，13000rpm离心60sec，弃19加250μl溶液P2，温和地上下翻转6~10次使菌体充分裂解，至溶液变清亮。取1.5ml菌液，9000rpm离心30秒，尽可能的倒干上清。用250μl溶液P1重悬菌体沉淀，枪头反复抽吸至菌体彻底悬浮。加400μl溶液P3，立即温和地上下翻转6~10次，放置5min。13000rpm离心10min，小心取上清。吸附柱置于收集管上，加500μl溶液P4，13000rpm离心1min，弃滤液。加500μl去蛋白液PE，13000rpm离心30~60sec，弃滤液。加500μl漂洗液WB，13000rpm离心30~60sec，弃滤液。（重复一次）取出吸附柱，放入干净离心管中，在吸附膜中间部位加40μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65~70℃水浴中加热效果更好），放置1min，13000rpm离心1min洗脱DNA，-20℃保存。空柱13000rpm离心2min。放置3~5min，除去残留乙醇。将上清液加入吸附柱中，13000rpm离心1min，弃滤液。加250μl溶液P2，温和地上下翻转6~10次使菌体充分裂解20琼脂糖凝胶电泳样品：10μl质粒样品+2μl上样缓冲液，混匀电泳：90~120mA，电泳20~40分钟配胶：琼脂糖凝胶粉，溶于TBE缓冲液中，配成1%~1.2%的琼脂糖凝胶上样：将样品用微量移液器加入凝胶孔中琼脂糖凝胶电泳样品：10μl质粒样品+2μl上样缓冲212000bp1000bp750bp500bp250bp100bpMarkerPEP－＋实验结果2000bp1000bp