专题二：1微生物的实验室培养课件

课题1微生物的实验室培养专题2:微生物的培养与应用微生物包括哪五类：病毒细菌放线菌真菌原生生物特点：结构简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构,且体内一般不含有叶绿素,不能进行光合作用.原核生物界原生生物界真菌界病毒界微生物基础知识病毒的结构SARS病毒、禽流感病毒朊病毒（蛋白质病毒）病毒的增殖：细菌的外形与大小细菌：单细胞不分枝的原核微生物。细菌细胞微小而透明，通常用适当染料染色后显微镜观察图1-1常见的三种细菌典型形态A.球菌B.杆菌

C.弧菌*细胞壁结构特点：坚韧且有弹性细胞壁有哪些功能？①固定细胞外形；

②保护细胞免受外力的损伤；

③阻拦大分子物质进人细胞；④使细胞具有致病性及对噬菌体的敏感性。伤寒杆菌细胞壁中含毒素菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落细菌的菌落特征因种而异：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度、边缘整齐度、厚度等方面各有特征。S型菌落(光滑)R型菌落(粗糙)S型：菌落表面光滑，不被免疫系统识别，有多糖荚膜，使人患肺炎或小鼠得败血症，有毒性。R型：菌落表面粗糙，被免疫系统识别，没有荚膜，无毒性。

肺炎双球菌细菌的营养类型根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为两大营养类型。1、自养菌（autotroph）2、异养菌（heterotroph）（1）腐生菌（2）寄生菌：大部分病原菌放线菌结构：单细胞原核分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）真菌如图是酵母菌电子显微镜下的形态结构酵母菌和霉菌青霉代谢类型基本碳源能源蓝藻硝化细菌圆褐固氮菌乳酸菌酵母菌红螺菌兼性营养型CO2与简单有机物光光能自养需氧型化能自养需氧型化能异养需氧型化能异养厌氧型化能异养兼性型CO2CO2糖类是最重要的碳源，尤其是葡萄糖光NH4+有机物微生物的营养类型1、了解有关培养基的基础知识；2、进行无菌技术的操作；3、进行微生物的培养。

一、课题目标：1、掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和平板划线法等基本操作技术；2、熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。无菌技术的操作。二、课题重点和难点：三、技能目标：一、基础知识：（一）培养基

是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质——培养基碳源、氮源、水和无机盐等营养物质，另外还需要满足微生物生长对特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、碱基)、pH、以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。如：乳酸杆菌培养基中要加维生素；培养霉菌时PH要调至酸性；培养细菌PH要调至中性或微碱性；厌氧微生物要提供无氧条件等1、培养基的物质组成：微生物所需的营养物质营养物质定义作用主要来源碳源（需要量最大，不同种类微生物对碳源要求差别很大）凡能提供所需碳元素的物质构成生物体的细胞物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质无机化合物（无机碳源）：CO2、NaHCO3有机化合物（有机碳源）：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等；糖类是最主要的碳源，尤其是葡萄糖营养物质定义作用主要来源氮源（最常用的氮源是铵盐、硝酸盐）凡能提供所需氮元素的物质合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物无机化合物（无机氮源）：N2、NH3、铵盐、硝酸盐有机化合物（有机氮源）：尿素、牛肉膏、蛋白胨等生长因子生长必不可少的微量有机物酶和核酸的组成成分维生素、氨基酸、碱基等（酵母膏、蛋白胨、动植物组织提取液等天然物质可提供）

构成微生物细胞以C、H、O、N、P、S六种元素为主，约占细胞干重的95％以上；Ca、K、Mg、Fe为大量元素，以无机盐阳离子形式被吸收，配培养基要加磷酸盐、硫酸盐。Zn、Ca、Mn、Co、Mo等微量元素，在微生物培养中有0.1PPM就可以了，自来水原料中已够用，不需另加。无机盐种类Cncnc-micro水Cncnc-micro

是细胞中生化反应的良好介质；营养物质和代谢产物都必须溶解在水里，才能被吸收或排出体（细胞）外。水的比热高，能有效的吸收代谢过程中放出的热量，不致使细胞的温度骤然上升。维持细胞的膨压（控制细胞形态）。（1）按物理状态来分：2.培养基的类型和用途固体培养基：用于菌种分离、计数和菌种鉴定；

半固体培养基：观察微生物的运动，保藏菌种；液体培养基：常用于发酵工业等；固体培养基：菌落，菌苔半固体培养基：无动力有动力(弥散)(是否运动)

液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长选择培养基：加入某种化学物质，抑制不需要的微生物的生长，促进或选择具有特定表型的微生物生长的培养基；如：青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌（抑制放线菌和细菌）高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌（抑制多种细菌生长）

加入抗生素的培养基:分离导入目的因基的受体细胞加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的（HAT）培养基:

分离杂交瘤细胞无氮培养基:分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物石油作唯一碳源的培养基：分离出分解石油污染的微生物（2）按功能来分，可分为选择培养基和鉴别培养基鉴别培养基：据微生物代谢特点，加入某种指示剂或化学药品，鉴别不同种类微生物的培养基.如：伊红、美蓝培养基：鉴别大肠杆菌等细菌（其代谢产物有机酸与伊红和美蓝结合)菌落呈深紫色并带有金属光泽大肠杆菌菌落呈深紫色,有金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征

（3）据化学成分来分，可分为天然培养基和合成培养基配制：天然培养基化学成分不明确的天然物质配制而成如玉米粉、牛肉膏等；用途：发酵工业的生产；优点：营养丰富，原料易得，配置方便简单，培养效果好；缺点：成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析，对营养物质的需要量难以确定，实验结果重复性差；易发生污染;配制：根据微生物生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。合成培养基用成分已知的化学物质配制而成，主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。用途：分类鉴定等科研实验优点：组分和含量相对固定，营养成分含量准确;缺点：缺少某些成分，一般微生物在上生长缓慢甚至不能生长，配置繁琐，成本高。合成培养基:天然培养基：半合成培养基配制：一部分天然有机物作碳源、氮源和生长因子，然后根据微生物对某些物质的需要量，适当加入某些化学药品配制而成；用途：在生产和实验中均应用较多；优点：营养丰富，培养效果好，某些成分易于控制，提高原料利用率；3.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方(参考教材附录内容)如：4、培养基配制原则：

（1）目的要明确：根据微生物的种类、培养目的等确定配制培养基的种类，因为不同的微生物对培养物质的需求不同。（2）营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。（3）pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同。细菌pH为：6.5-7.5；放线菌pH为：7.5-8.5；

真菌pH为：5.0-6.0。（二）无菌技术1.无菌技术的概念

无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。无论是随后将要学到的倒平板、平板划线操作，还是平板稀释涂布法，其操作中的每一步都需要做到“无菌”，即防止杂菌污染。只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。2.消毒与灭菌的概念及两者的区别

（１）消毒定义：指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部的部分微生物。（不包括芽孢和孢子）区分为高程度消毒（High-levelDisinfection）中程度消毒（Intermediate-levelisinfection）低程度消毒（Low-levelDisinfection）三种方式。（2）灭菌的定义：

用强烈的理化因素（化学剂或物理方法）杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，而达到完全无菌的过程。

灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。比较项理化因素的作用强度消灭微生物的数量芽孢和孢子能否被消灭消毒较为温和部分生活状态的微生物不能灭菌强烈全部微生物能消毒与灭菌的比较（1）对操作空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；（2）培养器皿、接种用具和培养基灭菌；（3）实验操作应在酒精灯火焰附近进行（为避免环境中微生物带来污染）；（4）操作时应避免已灭菌处理的材料用具与周围的物品接触；3.无菌技术操作的几个方面1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min，杀死微生物细胞和部分芽孢；2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min，杀死不耐高温的液体如牛奶中微生物，并使营养物质不被破坏；3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源；4、紫外线或化学药物消毒:如接种室、超净工作台或接种箱使用前紫外线照射30分钟，照射前适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液可加强消毒效果，以杀死物体表面或空气中的微生物；……(1)消毒的方法：4.常用的消毒与灭菌的方法1、灼烧灭菌：接种工具如接种环、接种针或其他金属用具，在酒精灯火焰充分燃烧层灼烧，快速彻底灭菌，试管口、瓶口等易被污染的部位也可灼烧灭菌2、干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。耐高温、需保持干燥物品如玻璃器皿（吸管、培养皿）、金属用具等（具体见附录4）3、高压蒸气灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min，如培养基灭菌；物品放入有水的高压蒸汽灭菌锅内，煮沸，彻底排出原有冷空气后密闭，加热灭菌，灭菌后彻底排气后才可开锅取出被灭菌物品；（具体见附录5）(2)灭菌的方法：无菌技术

定义常用方法微生物培养和组培中的应用消毒使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物煮沸玻璃仪器紫外线实验室、操作台、衣物等酒精溶液手、外植体等次氯酸钠溶液等外植体灭菌使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子高压蒸汽培养基、玻璃仪器、棉塞、牛皮纸等灼烧接种环、涂布器干热玻璃仪器1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。旁栏思考二、实验操作微生物实验室培养的基本操作程序1、器具的灭菌2、培养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存（一）制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）1．计算：据配方比例，计算100ml培养基的各种成分用量；2．称量：准确称取各成分，牛肉膏在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要迅速称取并盖好盖子；3．溶化：牛肉膏溶化后用玻璃棒取出称量纸，往烧杯中加入蛋白胨和氯化钠搅拌使溶解充分，（调pH:pH7.0-7.2），加入1.5-2g琼脂加热熔化，并不断搅拌防止溢出、糊底而至烧杯破裂，琼脂完全融化后补加蒸馏水至100ml；操作步骤4．灭菌:将50ml培养基用玻棒转移至三角瓶中，塞上棉塞，包上牛皮纸并用皮筋勒紧，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌15～30min。将培养皿用旧报纸包裹（5-8套为一包），放入干热灭菌箱内，在160～170℃下灭菌2h。5．倒平板:

待培养基冷却到50℃左右时（手摸不烫，但不能凝固时即可），在酒精灯火焰附近倒平板。（倒平板操作见课本）包器材包器材倒平板技术6．无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？问题讨论答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。(二)纯化大肠杆菌接种方法有：接种方法有很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法1.平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面.在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.平板划线的操作方法交叉划线法连续划线法

平板划线时不能划破培养基1、一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；2、二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。问题讨论

1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？

答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。2.稀释涂布平板法:将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基表面进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落（单细胞菌落）问题讨论

涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？

应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。微生物的恒温培养微生物的恒温培养:将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37℃恒温箱中培养12—24h后，分别观察并记录结果：微生物的恒温培养菌种的保藏：

为保持菌种纯净，需进行菌种保藏1、临时保藏：（频繁使用的菌种）接种到固体斜面培养基，适宜的温度下培养，菌落长成后置于4℃冰箱保藏。后每3—6个月都要转移到新的培养基上。缺点：保存时间不长；菌种易污染和变异；菌种的保藏：

为保持菌种纯净，需进行菌种保藏2、甘油冷冻管藏法：长期保存；在3ml甘油瓶中装入1ml甘油并灭菌，加入1ml菌液充分混匀在-20℃的冷冻箱中保存；四、课题成果评价

1、培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。2、接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。3、是否进行了及时细致的观察与记录培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。本课题知识小结:【典例解析】例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是A.是碳源的物质不可能同时是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐D.无机氮源也能提供能量解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。答案：D例2．下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是A.防止杂菌污染B.消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌D.灭菌必须在接种前B解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。编号成分含量①粉状硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml例3．右表是某微生物培养基成分，请据此回答：（1）右表培养基可培养的微生物类型是

。（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入

.自养型微生物

含碳有机物

（3）若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养

。（4）表中营养成分共有

类。（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是

。（6）右表中各成分重量确定的原则是

。（7）若右