AFP基因表达的检测-长沙小离课件

AFP基因表达检测RT-PCR(ReversetranscriptionPCR)

甲胎蛋白DNA序列mRNA反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR，RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。

实验原理被污染的试剂，缓冲液移液器使用的器皿及tip等操作者的手，头发等

RNA操作中应注意的问题：防止RNase污染外源RNase的主要来源：RNA的提取当处理RNA时，移液器专用保证RNA实验用的玻璃器皿、塑料制品和缓冲液等留出专用；溶液和试剂分装成小份保存；RNA电泳装置专用（清洗、处理、DEPC处理过的水冲洗）；防止外源RNase污染的主要措施准备所有的溶液和缓冲液时，使用无RNA酶的玻璃器皿，DEPC处理过的水，用于RNA的化学药品使用专用药勺或直接敲击瓶底分离，可能的话，用0.1％的DEPC在37ºC处理溶液1小时后在15psi(1.05kg/cm2高压蒸气灭菌15min。180－300ºC烘烤玻璃器皿4hrs以上或用其它灭活RNA酶的商品化产品处理塑料制品；使用新的、无RNA酶的一次性tubes,tips等；在分离RNA的过程中用RNA酶抑制剂以抑制RNA酶的活性。防止外源RNase污染的主要措施：材料要新鲜;裂解过程要同RNase活性抑制同步防止内源RNA酶降解RNADEPC:是高度活性的烷基化试剂，通过组胺基团乙氧基甲酸化形式破坏RNase的活性氧钒核糖核苷复合物:能与多种RNA酶活性位点结合并几乎百分之百地抑制RNA酶的活性RNA提取RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的调节和cDNA的合成都是必须的，RNA的纯度和完整性对于Northernblot,RT-PCR和cDNA文库的构建等分子生物学实验都至关重要。RNA分离的方法很多，最关键的因素是尽量减少RNA酶的污染。

实验目的：学习RNA的简易制备过程，通过RNA电泳带评价RNA质量

实验材料：水HCC患者的外周血单核细胞（PMNCs）AFPmRNA1.外周血单个核细胞(PMNCs)的分离取受检者外周血5ml,肝素抗凝。采用密度梯度离心法,用淋巴细胞分离液分离收集PMNCs。2..PMNCs的总RNA的提取用TrizolRNA提取液(GIBCOBRL),以改良的异硫氰酸胍-酚-氛仿一步法提取总RAN,放-80℃保存。并抽提HepG2细胞株的总RNA,放-80℃保存提取方法：RNA降解的主要原因取样后没有立即抽提RNA；抽提过程中超作不当，样品量超过了许可的范围；样品运输、保藏不当，或RNA保藏不当，应放入-70℃

，而不是-20℃）使用的溶液或器皿有RNase污染琼脂糖变性胶（甲醛）电泳时pH值低于3.5RNA污染的原因样品太多，所加试剂相对太少用来分离RNA的样品中含有机溶剂（乙醇，DMSO等），或碱溶液等RT-PCR(ReversetranscriptionPCR)

实验目的：学习RT-PCR的原理及其操作过程实验材料：PMNCs的mRNAPCR技术PCR（多聚酶链式反应〕是一种体外扩增特异DNA片段的技术，是分子克隆技术中最常用的技术之一，是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性（denaturation，）退火（annealing）、延伸（extension）三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。模板DNA：一般102－105个拷贝Mg2＋：Mg2＋能影响反应的特异性和扩增片段的产率。一般反应体系中1.5-2.5mmol/L反应反冲液：使TaqDNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。dNTP：在PCR反应体系中其浓度一般为20－200mol/L，浓度过高、过低都不利。TaqDNA聚合酶：在70－75C具最高活性。具有5’－3’的聚合酶活性和5’－3’的外切酶活性，无校正功能。是镁依赖性酶。引物：PCR反应中引物浓度一般为0.1－0.5mol/L。PCR反应体系中的主要成分及其作用：RT-PCRRT-PCR所用引物由中科院上海生物工程公司合成,引物序列如下:AFP上游引物:5'-TGCAGCCAAAGTGAAGAGGG-3';AFP下游引物:5'-CAAGCTGCTTTCTCTTAATTC-3'β-actin上游引物:5'-TCTACAATGAGCTGCGTGTGG-3'β-actin下游引物,5'GGAACCGCTCATTGCCAATG-3'。β-actin作为内参照。同时以HepG2总PNA作为阳性对照、水作为阴性对照进行扩增,排除假阳性和假阴性的情况。取1μg总RNA加入随机引物0.5μg,70℃温浴5分钟,迅速放置冰浴中,再加入2.5mMdNTP4μl,RNA酶抑制剂25u,5xRT缓冲液5μl,MMLV逆转录酶(Promega)200u,加DEPC处理水至总体积25μl。

37℃温浴1小时,迅速放于冰中,-80℃冰箱保存。反转录再加入10xPCR缓冲液5μl,25mMMgCl2溶液3μl,TaqDNA聚合酶2u,加去离子水至总体积50μl。94℃变性30秒,59.5℃退火30秒,72℃延伸40秒,共进行30个循环,末次循环后72℃延伸7分钟。PCR反应循环条件设置：

根据引物及基因的表达水平设置循环参数：如引物序列、引物长度、扩增片段的长度及mRNA的丰度等退火及延伸同时以HepG2总RNA作为阳性对照、水作为阴性对照进行扩增,排除假阳性和假阴性的情况。阳性对照组：用倍比稀释法将不同数量的HepG2细胞加入到10ml正常人外周血中(白细胞107/ml),再提取PMNCs的总RNA并行RT-PCR对照实验Taq酶过多；Mg2+浓度不合适；引物浓度过高或设计不合理；复性温度过低；循环次数过多；模板量过多；PCR产物的电泳检测时出现拖带或非特异性扩增带的可能原因：PCR扩增产物电泳检测点样或染胶问题反应体系中忘记加入某种成分(无扩增产物）或分装mixture时出了问题；目的片段太大，使用的