组香菇多糖对荷瘤小鼠胸腺树突状细胞表达的影响课件

组香菇多糖对荷瘤小鼠胸腺树突状细胞表达的影响组香菇多糖对荷瘤小鼠胸腺树突状细胞表达的影响背景肿瘤已成为人类健康的头号杀手，肿瘤的治疗研究也是生物医学领域一个炙手可热的方向。*由于肿瘤抗原的存在，势必被机体免疫系统所识别，并由此激发特异性免疫反应，包括细胞免疫和体液免疫。*在细胞免疫方面，T淋巴细胞、K细胞（抗体依赖性细胞毒细胞）、NK细胞（自然杀伤细胞）和巨噬细胞对肿瘤细胞均具杀伤作用。*肿瘤的体液免疫主要是抗肿瘤抗体对肿瘤细胞的破坏效应。背景*由于肿瘤抗原的存在，势必被机体免疫系统所识别，并由此激研究现状从香菇的子实体提取物中获取的主要有效分——香菇多糖，作为一种天然的免疫调节剂，对各种恶性肿瘤有较好的防治作用[1]。香菇多糖在实验动物中有促进B淋巴细胞的分化、增殖，增强免疫功能的作用[2,3]。Mushiake等[4]的研究结果还表明：香菇多糖能通过改善树突状细胞的功能，调节DCs介导的特异性免疫，增强抗瘤活性，最终提高荷瘤鼠的存活率。研究现状树突状细胞与抗癌——树突状细胞树突状细胞来源人树突状细胞起源于造血干细胞。DC的来源有两条途径。树突状细胞与抗癌——树突状细胞树突状细胞来源树突状细胞与抗癌——树突状细胞树突状细胞主要功能机体功能最强的专职抗原递呈细胞(APC)树突状细胞与抗癌——树突状细胞树突状细胞主要功能树突状细胞与抗癌——树突状细胞抗肿瘤

外周DCs可迁入胸腺，以便更高效率地诱导T细胞分化增殖，由它激活的细胞免疫应答在机体抗肿瘤中起主导作用[6,7]。1、MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子—抗原呈递分子共刺激分子→第二信号2、DC与T细胞结合IL-12、IL-18→T细胞增殖，诱导CTL生成，主导Th1型免疫应答，利于肿瘤清除；激活穿孔素P颗粒酶B和FasL/Fas介导的途径增强NK细胞毒作用；3、趋化因子(CCK)：CD4+T趋化、长期存在；正反馈旁分泌方式活化DC；某些抗血管生成物质(如IL-12、IFN-γ)及前血管生成因子而影响肿瘤血管的形成。CD8+T树突状细胞与抗癌——树突状细胞抗肿瘤外周DCs香菇多糖与DC—香菇多糖香菇多糖活性成分：β—(1—3)—D—葡聚糖香菇多糖与DC—香菇多糖香菇多糖活性成分：β—(1—3)—D香菇多糖与DC—香菇多糖抗肿瘤香菇多糖与DC—香菇多糖抗肿瘤本实验将通过观察胸腺结构，S100和CD1a免疫组化标记（S100标记成熟的TDCs，用CD1a标记未成熟TDCs。），计算S100+细胞在参照物(胸腺)中所占面积百分比，计算TDCs密度，测算胸腺指数、肿瘤指数、抑瘤率等指标，探讨香菇多糖对荷瘤小鼠S100+胸腺树突状细胞(TDCs)和CD1a+TDCs表达的影响。原创点：

阐明香菇多糖能增加TDCs数量及促进其分化成熟。

组香菇多糖对荷瘤小鼠胸腺树突状细胞表达的影响课件实验设计实验室要求实验步骤观察指标统计分析预期实验结果组香菇多糖对荷瘤小鼠胸腺树突状细胞表达的影响课件实验室要求实验仪器实验对象药品试剂组香菇多糖对荷瘤小鼠胸腺树突状细胞表达的影响课件实验室要求——实验仪器SABC试剂盒精密天平组织匀浆机泡沫盒放液氮的小型保温杯或者液氮罐血球计数板进口样本冻存管50个小鼠取组织学标本用手术器械2套1ml注射器30支DT2000图像分析软件V2.0统计分析软件SPSS19.0实验室要求——实验仪器实验室要求——实验对象清洁级ICR小鼠，雌雄各半，20-25g，60只（由浙江大学实验中心提供）实验室要求——实验对象实验室要求——药品试剂小鼠S180细胞株兔抗小鼠S100兔抗小鼠CD1a注射用香菇多糖环磷酰胺4%甲醛固定液1500ml组织固定用250ml4%甲醛2瓶（敞口瓶+瓶盖）生理盐水1000ml液氮5L实验室要求——药品试剂实验方法荷瘤S180鼠模型的建立动物分组普通光镜检查免疫组织化学标记和观察分析胸腺指数，肿瘤指数，抑瘤率的计算实验方法

实验方法——荷瘤S180鼠模型的建立

取已接种7d肿瘤生长良好的S180腹水型小鼠，抽吸乳白色的浓稠腹水以无菌生理盐水稀释后，用血球计数板进行活细胞计数，调整细胞数为1×107，制成肿瘤细胞悬液(活细胞率﹥95%)。在小鼠右前腋皮下注射0.2mlS180细胞悬液，制成实体瘤模型。

实验方法——荷瘤S180鼠模型的建立

实验方法——动物分组组号(n=10)组名处理第1天第2~8天第9天Ⅰ生理盐水对照组静脉注射0.2ml生理盐水制片HE染色观察胸腺结构S100和CD1a免疫组化标记计算S100+细胞在参照物(胸腺)中所占面积百分比④计算TDCs密度⑤测算胸腺指数、肿瘤指数、抑瘤率等指标Ⅱ荷瘤模型组接种肿瘤每日静脉注射生理盐水0.2mlⅢ荷瘤环磷酰胺组每日静脉注射环磷酰胺0.2ml(每只每次1mg)Ⅳ荷瘤香菇多糖低浓度组每日静脉注射香菇多糖0.1ml(每只每次0.0125mg)Ⅴ荷瘤香菇多糖中浓度组每日静脉注射香菇多糖0.3ml(每只每次0.0375mg)Ⅵ荷瘤香菇多糖高浓度组每日静脉注射香菇多糖0.5ml(每只每次0.625mg)实验方法——动物分组组号组名处理第1天第2~8天第9天Ⅰ生理

实验方法——普通光镜检查胸腺结构

小鼠断头处死，剥离胸腺组织，称重后入4%多聚甲醛溶液中固定。低温石蜡包埋制片，HE染色，显微镜观察。

实验方法——普通光镜检查胸腺结构

实验方法——免疫组织化学标记和观察分析

将胸腺石蜡标本制成厚4μm的石蜡切片。0.1%胰蛋白酶消化30min(37℃)，一抗4℃过夜(S100和CD1a工作浓度均为1∶150)。按试剂盒作SABC免疫组化技术处理。DAB显色。阴性对照：以PBS代替一抗。用DT2000图像分析软件V2.0计数单位面积胸腺切片中阳性颗粒的个数和面积，计算S100+细胞在参照物(胸腺)中所占面积百分比。使用DigiLab2.0、MoticImagesPlus2.0ML软件计算TDCs密度：每组随机选取50个高倍视野拍照(0.068mm2)，计数S100+细胞的个数。TDCs密度=50个高倍视野S100+细胞总和/3.4mm2(阳性颗粒最小直径≥2μm时认作一个细胞)。

实验方法——免疫组织化学标记和观察分析

实验方法——观测、计算及分析

观测指标肿瘤质量胸腺质量小鼠体质量计算胸腺指数(mg/g)=胸腺质量(mg)/小鼠体质量(g)肿瘤指数(mg/g)=肿瘤质量(mg)/小鼠体质量(g)抑瘤率(%)=(荷瘤模型组肿瘤质量-荷瘤药物实验组肿瘤质量)/荷瘤模型组肿瘤质量×100%统计分析采用统计学软件包SPSS19.0，结果用x±s表示，各实验组之间的比较采用单因素方差分析，显著性检验水准为α=0.05。

实验方法——观测、计算及分析

观测指标

预期实验结果切片观察—胸腺结构接种肿瘤小鼠胸腺均萎缩：胸腺皮质变薄，胸腺细胞稀疏，皮、髓质分界不清；胸腺皮、髓质的细胞密度比例降低。而电镜下观察到胸腺细胞退化萎缩，出现了大量的脂肪、纤维、凋亡的胸腺细胞，线粒体肿胀，嵴减少，出现大小不等的空泡，核固缩。萎缩程度：

预期实验结果

预期实验结果HE染色—切片观察对比观察免疫组化染色及HE染色切片，可见HE染色中显示的TDCs多数能表达S100和CD1a。S100标记示TDCs胞浆内有深棕色颗粒表达(部分TDCs细胞核也有表达)。CD1a标记主要表达在TDCs细胞膜上，呈棕色阳性反应。环磷酰胺组、荷瘤香菇多糖组胸腺皮质中见大量S100阳性表达的TDCs，髓质有数量较少的TDCs，但细胞体积较大；而正常对照组、荷瘤模型组胸腺髓质S100阳性表达TDCs量很少。

预期实验结果HE染色—切片观察预期实验结果S100+细胞在参照物(胸腺)中所占面积百分比TDCs密度光镜下药物组TDCs数量明显增加，特别在胸腺皮质密度很高。胸腺指数(mg/g)接种肿瘤小鼠胸腺指数均下降，与正常对照组相比具有统计学意义荷瘤环磷酰胺组小鼠胸腺指数回升，其指数与荷瘤模型组相比具有统计学意义(P<0.01)。荷瘤香菇多糖组小鼠胸腺指数回升，其指数与荷瘤模型组相比具有统计学意义(P<0.01)。且随浓度升高，指数回升更多，指数更加接近于正常对照组小鼠。肿瘤指数(mg/g)抑瘤率(%)预期实验结果S100+细胞在参照物(胸腺)中所占面积百分比

可行性分析实验动物和实验器材、试剂由实验中心提供，实验时间充裕，经费充裕。实验设计均是基于一定的文献基础，根据前人的实验结果，该实验流程和方法是完全可行的。

可行性分析实验动物和实验器材、试剂由实验中心提供，实验时讨论研究表明，香菇多糖具广泛的免疫调节作用，可通过增加脾细胞增殖和IL-2的表达水平，以及通过激活脾细胞受体信号转导等方式增强免疫[5]。DCs是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，它几乎存在于所有哺乳类动物组织中，通过识别和传递抗原肽给T细胞而参与免疫，外周DCs可迁入胸腺，以便更高效率地诱导T细胞分化增殖，由它激活的细胞免疫应答在机体抗肿瘤中起主导作用[6,7]。荷瘤机体免疫机制的失能不是由于缺乏肿瘤抗原，可能就是由于DCs的功能缺陷导致这些抗原不能被有效地提呈给T淋巴细胞，从而不能诱导细胞毒性T淋巴细胞产生有效而特异性的免疫应答。讨论讨论TDCs有多种在细胞水平标记和识别的方法。通常用S100标记成熟的TDCs，用CD1a标记未成熟TDCs。本实验通过多种树突状细胞标记物联合标记，结合光镜形态观察，表明小鼠荷S180肉瘤后，TDCs数量减少，而在应用香菇多糖后TDCs数量增加。尤其是S100+TDCs，即成熟TDCs增加，且不仅出现在皮质，在胸腺髓质也出现较多体积较大的成熟TDCs。与其他各组比较，荷瘤香菇多糖组TDCs密度增加具有统计意义(P<0.01)。讨论实验讨论以上结果表明：香菇多糖能增加TDCs数量并促进其分化成熟，增强其抗原提呈能力，从而加强活化T细胞启动细胞免疫功能。这可能是香菇多糖抗肿瘤的机理之一。实验讨论以上结果表明：香菇多糖能增加TDCs数量并促进其分化组香菇多糖对荷瘤小鼠胸腺树突状细胞表达的影响组香菇多糖对荷瘤小鼠胸腺树突状细胞表达的影响背景肿瘤已成为人类健康的头号杀手，肿瘤的治疗研究也是生物医学领域一个炙手可热的方向。*由于肿瘤抗原的存在，势必被机体免疫系统所识别，并由此激发特异性免疫反应，包括细胞免疫和体液免疫。*在细胞免疫方面，T淋巴细胞、K细胞（抗体依赖性细胞毒细胞）、NK细胞（自然杀伤细胞）和巨噬细胞对肿瘤细胞均具杀伤作用。*肿瘤的体液免疫主要是抗肿瘤抗体对肿瘤细胞的破坏效应。背景*由于肿瘤抗原的存在，势必被机体免疫系统所识别，并由此激研究现状从香菇的子实体提取物中获取的主要有效分——香菇多糖，作为一种天然的免疫调节剂，对各种恶性肿瘤有较好的防治作用[1]。香菇多糖在实验动物中有促进B淋巴细胞的分化、增殖，增强免疫功能的作用[2,3]。Mushiake等[4]的研究结果还表明：香菇多糖能通过改善树突状细胞的功能，调节DCs介导的特异性免疫，增强抗瘤活性，最终提高荷瘤鼠的存活率。研究现状树突状细胞与抗癌——树突状细胞树突状细胞来源人树突状细胞起源于造血干细胞。DC的来源有两条途径。树突状细胞与抗癌——树突状细胞树突状细胞来源树突状细胞与抗癌——树突状细胞树突状细胞主要功能机体功能最强的专职抗原递呈细胞(APC)树突状细胞与抗癌——树突状细胞树突状细胞主要功能树突状细胞与抗癌——树突状细胞抗肿瘤

外周DCs可迁入胸腺，以便更高效率地诱导T细胞分化增殖，由它激活的细胞免疫应答在机体抗肿瘤中起主导作用[6,7]。1、MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子—抗原呈递分子共刺激分子→第二信号2、DC与T细胞结合IL-12、IL-18→T细胞增殖，诱导CTL生成，主导Th1型免疫应答，利于肿瘤清除；激活穿孔素P颗粒酶B和FasL/Fas介导的途径增强NK细胞毒作用；3、趋化因子(CCK)：CD4+T趋化、长期存在；正反馈旁分泌方式活化DC；某些抗血管生成物质(如IL-12、IFN-γ)及前血管生成因子而影响肿瘤血管的形成。CD8+T树突状细胞与抗癌——树突状细胞抗肿瘤外周DCs香菇多糖与DC—香菇多糖香菇多糖活性成分：β—(1—3)—D—葡聚糖香菇多糖与DC—香菇多糖香菇多糖活性成分：β—(1—3)—D香菇多糖与DC—香菇多糖抗肿瘤香菇多糖与DC—香菇多糖抗肿瘤本实验将通过观察胸腺结构，S100和CD1a免疫组化标记（S100标记成熟的TDCs，用CD1a标记未成熟TDCs。），计算S100+细胞在参照物(胸腺)中所占面积百分比，计算TDCs密度，测算胸腺指数、肿瘤指数、抑瘤率等指标，探讨香菇多糖对荷瘤小鼠S100+胸腺树突状细胞(TDCs)和CD1a+TDCs表达的影响。原创点：

阐明香菇多糖能增加TDCs数量及促进其分化成熟。

组香菇多糖对荷瘤小鼠胸腺树突状细胞表达的影响课件实验设计实验室要求实验步骤观察指标统计分析预期实验结果组香菇多糖对荷瘤小鼠胸腺树突状细胞表达的影响课件实验室要求实验仪器实验对象药品试剂组香菇多糖对荷瘤小鼠胸腺树突状细胞表达的影响课件实验室要求——实验仪器SABC试剂盒精密天平组织匀浆机泡沫盒放液氮的小型保温杯或者液氮罐血球计数板进口样本冻存管50个小鼠取组织学标本用手术器械2套1ml注射器30支DT2000图像分析软件V2.0统计分析软件SPSS19.0实验室要求——实验仪器实验室要求——实验对象清洁级ICR小鼠，雌雄各半，20-25g，60只（由浙江大学实验中心提供）实验室要求——实验对象实验室要求——药品试剂小鼠S180细胞株兔抗小鼠S100兔抗小鼠CD1a注射用香菇多糖环磷酰胺4%甲醛固定液1500ml组织固定用250ml4%甲醛2瓶（敞口瓶+瓶盖）生理盐水1000ml液氮5L实验室要求——药品试剂实验方法荷瘤S180鼠模型的建立动物分组普通光镜检查免疫组织化学标记和观察分析胸腺指数，肿瘤指数，抑瘤率的计算实验方法

实验方法——荷瘤S180鼠模型的建立

取已接种7d肿瘤生长良好的S180腹水型小鼠，抽吸乳白色的浓稠腹水以无菌生理盐水稀释后，用血球计数板进行活细胞计数，调整细胞数为1×107，制成肿瘤细胞悬液(活细胞率﹥95%)。在小鼠右前腋皮下注射0.2mlS180细胞悬液，制成实体瘤模型。

实验方法——荷瘤S180鼠模型的建立

实验方法——动物分组组号(n=10)组名处理第1天第2~8天第9天Ⅰ生理盐水对照组静脉注射0.2ml生理盐水制片HE染色观察胸腺结构S100和CD1a免疫组化标记计算S100+细胞在参照物(胸腺)中所占面积百分比④计算TDCs密度⑤测算胸腺指数、肿瘤指数、抑瘤率等指标Ⅱ荷瘤模型组接种肿瘤每日静脉注射生理盐水0.2mlⅢ荷瘤环磷酰胺组每日静脉注射环磷酰胺0.2ml(每只每次1mg)Ⅳ荷瘤香菇多糖低浓度组每日静脉注射香菇多糖0.1ml(每只每次0.0125mg)Ⅴ荷瘤香菇多糖中浓度组每日静脉注射香菇多糖0.3ml(每只每次0.0375mg)Ⅵ荷瘤香菇多糖高浓度组每日静脉注射香菇多糖0.5ml(每只每次0.625mg)实验方法——动物分组组号组名处理第1天第2~8天第9天Ⅰ生理

实验方法——普通光镜检查胸腺结构

小鼠断头处死，剥离胸腺组织，称重后入4%多聚甲醛溶液中固定。低温石蜡包埋制片，HE染色，显微镜观察。

实验方法——普通光镜检查胸腺结构

实验方法——免疫组织化学标记和观察分析

将胸腺石蜡标本制成厚4μm的石蜡切片。0.1%胰蛋白酶消化30min(37℃)，一抗4℃过夜(S100和CD1a工作浓度均为1∶150)。按试剂盒作SABC免疫组化技术处理。DAB显色。阴性对照：以PBS代替一抗。用DT2000图像分析软件V2.0计数单位面积胸腺切片中阳性颗粒的个数和面积，计算S100+细胞在参照物(胸腺)中所占面积百分比。使用DigiLab2.0、MoticImagesPlus2.0ML软件计算TDCs密度：每组随机选取50个高倍视野拍照(0.068mm2)，计数S100+细胞的个数。TDCs密度=50个高倍视野S100+细胞总和/3.4mm2(阳性颗粒最小直径≥2μm时认作一个细胞)。

实验方法——免疫组织化学标记和观察分析

实验方法——观测、计算及分析

观测指标肿瘤质量胸腺质量小鼠体质量计算胸腺指数(mg/g)=胸腺质量(mg)/小鼠体质量(g)肿瘤指数(mg/g)=肿瘤质量(mg)/小鼠体质量(g)抑瘤率(%)=(荷瘤模型组肿瘤质量-荷瘤药物实验组肿瘤质量)/荷瘤模型组肿瘤质量×100%统计分析采用统计学软件包SPSS19.0，结果用x±s表示，各实验组之间的比较采用单因素方差分析，显著性检验水准为α=0.05。

实验方法——观测、计算及分析

观测指标

预期实验结果切片观察—胸腺结构接种肿瘤小鼠胸腺均萎缩：胸腺皮质变薄，胸腺细胞稀疏，皮、髓质分界不清；胸腺皮、髓质的细胞密度比例降低。而电镜下观察到胸腺细胞退化萎缩，出现了大量的脂肪、纤维、凋亡的胸腺细胞，线粒体肿胀，嵴减少，出现大小不等的空泡，核固缩。萎缩程度：

预期实验结果

预期实验结果HE染色—切片观察对比观察免疫组化染色及HE染色切片，可见HE染色中显示的TDCs多数能表达S100和CD1a。S100标记示TDCs胞浆内有深棕色颗粒表达(部分TDCs细胞核也有表达)。CD1a标记主要表达在TDCs细胞膜上，呈棕色阳性反应。环磷酰胺组、荷瘤香菇多糖组胸腺皮质中见大量S100阳性表达的TDCs，髓质有数量较少的TDCs，但细胞体积较大；而正常对照组、荷瘤模型组胸腺髓质S100阳性表达TDCs量很少。

预期实验结果HE染色—切片观察预期实验结果S100+细胞在参照物(胸腺)中所占面积百分比TDCs密度光镜下药物组TDCs数量明显增加，特别在胸腺皮质密度很高。胸腺指数(mg/g)接种肿瘤小鼠胸腺指数均下降，与正常对照组相比具有统计学意义荷瘤环磷