重组DNA技术课件

第十八章重组DNA技术Chapter18TechniquesofRecombinantDNA第十八章重组DNA技术◆DNA分子体外重组技术和核苷酸序列分析技术标志了基因工程时代的诞生。◆1973年，HerbertBoyer和StanleyCohen首次成功实现DNA分子的体外重组。◆1977年，FrederickSanger和WalterGilbert发明了DNA测序法。◆重组DNA技术(recombinantDNAtechnique)：指在体外重新组合DNA分子，并使它们在适当的细胞中增殖的遗传操作。◆DNA分子体外重组技术和核苷酸序列分析技术标志了基因工程◆遗传工程(GeneticEngineering)：借助生物学技术，对生物遗传物质进行更改和/或重新组合，以改变生物的遗传性状或创造新的生物品种的遗传学研究技术。◆遗传工程有广义和狭义之别，狭义遗传工程专指重组DNA技术(即基因工程)，广义遗传工程包括细胞水平的遗传操作(也称细胞工程)和基因工程。◆克隆：是英文“clone

”或“cloning

的音译，源于希腊文“Klone”，本意为无性繁殖系，即通过无性繁殖而产生的完全相同的子代集合体。◆遗传工程(GeneticEngineering)：借助重组DNA技术的基本步骤

重组DNA技术的基本步骤第一节重组DNA技术中的酶Section1EnzymesinDNARecombination第一节酶功能限制性核酸内切酶识别特异性核苷酸序列切割DNADNA连接酶催化相邻DNA片段的3'末端与5'末端生成磷酸二酯键DNA聚合酶催化合成DNA分子反转录酶以RNA为模板，催化合成cDNA碱性磷酸酶切除末端磷酸基末端转移酶在3'-羟基末端进行多聚物加尾多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5'-羟基末端磷酸化，或用来标记探针重组DNA技术中常用工具酶酶功能限制性核酸内切酶识别特异性核苷酸序列切割一、限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)1.定义◆限制性内切酶：又称限制性核酸内切酶，能识别结合双链DNA分子中的特异序列，并切割DNA。2.命名

◆由三个斜体字母组成：EcoRI来源菌属名(Escherichia)的第一个字母菌的种名(coli)R来自菌株名罗马数字(I)代表该酶被发现的次序5'···GGATCC···3'3'···CCTAGG···5'BamHI5'···GGATCC···3'3'···CCTAGG···5'一、限制性核酸内切酶(restrictionenzyme3.限制酶的分类根据作用特征可以分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三种类型

(1)三型限制酶的基本特征◆Ⅰ型：具有内切酶和甲基化酶的双重活性，作用需ATP供能，能识别和结合于特定的DNA序列位点，但随机切断在识别位点以外的DNA序列（通常在识别位点周围400~700bp）。◆Ⅲ型：具有内切酶和甲基化酶的双重活性，作用需ATP供能，切割位点距离识别位点约25bp。3.限制酶的分类◆Ⅰ型：具有内切酶和甲基化酶的双重活性，(2)Ⅱ型限制性核酸内切酶◆只由一条肽链组成，不具有甲基修饰酶活性，不需要ATP◆识别位点一般为4~6碱基对组成的特异性序列。◆切割后可产生粘性末端，也可产生平头末端。5'突出的粘性末端5'···GGATCC···3'3'···CCTAGG···5'5'···GGATCC···3'3'···CCTAGG···5'BamHI(2)Ⅱ型限制性核酸内切酶◆只由一条肽链组成，不具有甲5'···GAGCTC···3'3'···CTCGAG···5'5'···GAGCTC···3'3'···CTCGAG···5'SstI3'突出末端5'···GAGCTSmaI5'···CCCGGG···3'3'···GGGCCC···5'5'···CCCGGG···3'3'···GGGCCC···5'平头末端SmaI5'···CCCGGG···3'3'··二、DNA连接酶(DNAligases)◆常用的连接酶为T4连接酶，既可以连接粘性末端，也可以连接平头末端。◆温度是影响连接反应效率的重要因素，通常在4~26℃进行连接反应。二、DNA连接酶(DNAligases)◆常用的连接酶为不同类型的限制性内切酶的切点性质以及粘端之间的退火不同类型的限制性内切酶的切点性质以及粘端之间的退火第二节载体Section2Vectors第二节载体◆DNA载体：是指具有接受外源DNA片段并能导入宿主细胞进行自主复制的特定DNA分子。◆克隆载体用于克隆基因或DNA片段的载体。◆用于表达一个基因则称为表达载体。◆载体的特点：(1)含有复制起始点(2)体积小◆DNA载体：是指具有接受外源DNA片段并能导入宿主细胞进(3)不能插入到基因组中，易于分离和纯化(4)含有选择性标记(5)含有克隆位点(5)具有适当的长度◆表达载体则除了上述特征外，还应在所要表达的基因上游具有转录启动子，下游有转录终止子等；很多表达载体还具有核糖体结合位点。(3)不能插入到基因组中，易于分离和纯化◆表达载体则除了一、克隆载体1.质粒载体◆通常为天然质粒的人工改良DNA。

(1)pBR322为最早发展的常用克隆载体之一，具有如下特点：①带有一个复制起始位点②具有Ampr和Tetr二个抗性基因，可插入失活③具有较小的分子量(4.36kb)④可插入较大外源片段(~6kb)⑤拷贝数较高(可达1000~3000)一、克隆载体1.质粒载体为最早发展的常用克隆载体之一，具有质粒pBR322示意图质粒pBR322示意图(2)pUC系列质粒◆由pBR322改建而成，主要特征为：①有复制起始位点(ori，源于pBR322)②Ampr基因(酶切位点不再单一)③含有LacZ'基因④含有多克隆位点区段◆pUC系列大多数是成对的，如pUC8/pUC9、pUC18/pUC19(2)pUC系列质粒①有复制起始位点(ori，源于pBRpUC18/19质粒的基本结构pUC18/19质粒的基本结构◆

pUC系列质粒的优点：①具有更小的分子量和更高的拷贝数②适应于组织化学筛选重组体(蓝白斑实验)③pUC系列提供多克隆位点(MCS)2．噬菌体载体◆常用于大片段DNA的克隆，实验中以λ噬菌体、M13和粘粒最为常用◆pUC系列质粒的优点：2．噬菌体载体◆常用于大片段DN3.人工染色体◆人工染色体(artificialchromosomes)：由染色体的复制元件构建的载体，是为克隆更大片段的DNA而发展的新型载体。◆人工染色体主要包括三种：细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)和哺乳动物人工染色体(MAC)◆YAC载体的复制元件包括：复制起点序列(即自主复制序列，ARS)、着丝粒(centromere,CEN)和两个端粒(TEL)。3.人工染色体◆人工染色体(artificialchr二、表达载体根据表达载体的结构特点：原核表达载体酵母表达载体昆虫细胞表达载体哺乳动物细胞表达载体植物细胞表达载体等二、表达载体根据表达载体的结构特点：1.原核表达载体(1)原核表达载体的结构特点：①强启动子常用启动子：Lac启动子、Trp启动子、T7噬菌体启动子②转录终止子：T7终止子等③SD序列：提供核糖体的结合位点1.原核表达载体(1)原核表达载体的结构特点：(2)

原核表达载体表达特点：①非融合型表达蛋白②融合型表达蛋白③分泌型表达蛋白(2)原核表达载体表达特点：XhoI(158)NotI(166)EagI(166)HindIII(173)SalI(179)SacI(190)EcoRI(192)BamHI(198)NheI(231)NdeI(238)NcoI(296)T7Promoter(370-386bp)T7Terminator(26-72bp)XhoI(158)T7PromoterT7TerminT7启动子Lac操纵序列rbs(SD序列)T7终止子MCSNcoI(CCATGG)His标签His标签凝血酶位点pET-28a-c(+)克隆表达区结构特征T7启动子Lac操纵序列rbsT7终止子MCSNcoI(HindIIIKpnISacIBamHIBstXIEcoRIBstXINotIXhoISphIXbaI2.酵母表达载体◆一般为质粒型穿梭载体。酵母表达载体pYES2HindIII2.酵母表达载体◆一般为质粒型穿梭载体。①选择性标志◆通常利用营养缺陷型突变作为筛选的标记，如常用的：URA3、LEU2、HIS3和TRP1。②复制子◆通常利用啤酒酵母2μm环质粒的复制起始序列。③常用的启动子◆常用的酵母基因启动子：醇脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、蔗糖酶、酸性磷酸酯酶和酵母交配因子(MFα)。(1)酵母表达载体的结构特点①选择性标志◆通常利用营养缺陷型突变作为筛选的标记，如常④上游活性序列◆上游活性序列的功能类似于增强子，可促进转录。⑤终止序列◆可终止转录，还可增加mRNA的数量和蛋白质表达的总量。⑥特定蛋白结构域◆如信号肽序列和核定位序列等。④上游活性序列◆上游活性序列的功能类似于增强子，可促进转(2)酵母表达载体的表达形式①直接表达②分泌性表达◆外源蛋白质表达后积累于酵母细胞质中，如人乙型肝炎表面抗原的表达。◆外源蛋白质表达后在信号肽指导下分泌至细胞外，信号因子通常为α因子前导序列，Invitrogen公司的酵母表达载体pGAPZα属于此种类型。(2)酵母表达载体的表达形式①直接表达②分泌性表达◆3.哺乳动物表达载体◆哺乳动物细胞表达外源蛋白的优势是可被修饰。◆常用的哺乳动物细胞表达宿主：中国仓鼠卵巢细胞(CHO)

猴肾细胞(COS)等◆哺乳动物细胞表达载体一般为穿梭型载体，含有真核细胞表达相应序列，如Invitrogen公司开发的pcDNA3.3-TOPO。3.哺乳动物表达载体◆哺乳动物细胞表达外源蛋白的优势是可哺乳动物表达载体pcDNA3.1哺乳动物表达载体pcDNA3.1第三节重组DNA操作的基本过程Section3ProtocolsofDNARecombination第三节DNA重组的基本过程：

1.靶基因DNA片段的制备

2.适宜载体的选择和制备

3.DNA片段与载体的连接

4.重组DNA转化宿主细胞

5.含有重组DNA宿主菌的筛选

6.重组DNA分子的鉴定DNA重组的基本过程：基因组DNA质粒载体限制酶目的基因序列重组后含有外源基因的载体DNA连接酶基因组DNA质粒载体限目的基因序列重组后含有外源基因的载体D转化扩增转化扩增重组DNA技术的基本步骤

重组DNA技术的基本步骤一、目的DNA片段的制备◆来源与方法：基因组DNA、cDNA、PCR产物和化学合成的DNA。◆基因文库(genelibrary)：也称基因组文库(genomelibrary)，用限制酶切割基因组DNA获得成千上万的在一定大小范围内的DNA片段，每一个DNA片段与载体分子连接，产生一个重组DNA分子的混合物，重组DNA分子转化宿主菌后，每一个转化细胞含有一个重组DNA分子，这些克隆的集合体被称为基因文库。一、目的DNA片段的制备◆来源与方法：基因组DNA、cDN基因组文库的构建基因组文库的构建◆

cDNA文库(cDNAlibrary)：提取细胞总mRNA，经反转录获得总cDNA，每一个cDNA分子与载体连接产生了一个重组DNA分子的混合物，再转化宿主菌，每个宿主菌细胞克隆将含有一个cDNA重组分子，这些克隆的集合体被称为cDNA文库。◆

若目的序列全部已知，可以通过人工合成的方法获取靶序列。◆

已知目的序列两端序列时，可以通过PCR方法获取靶序列。◆cDNA文库(cDNAlibrary)：提取细胞总mRcDNA文库的构建cDNA文库的构建二、载体的选择与准备◆选择原则：依据重组DNA的目的，选择适当载体。适合的选择标记克隆载体表达载体细菌载体酵母载体昆虫细胞载体哺乳动物细胞载体二、载体的选择与准备◆选择原则：依据重组DNA的目的，选择三、DNA分子的体外重组◆互补性粘性末端将使连接更容易。限制酶粘性末端连接T-载体粘性末端连接平末端连接同聚物加尾连接人工接头连接三、DNA分子的体外重组◆互补性粘性末端将使连接更容易。限BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连限制酶粘性末端连接目录BamHⅠ切割反应GGATCCT4DNA连接酶GATC目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目录平末端链接目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶重组体3.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。3.同聚物加尾连接5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶

5´3´

3´5´

5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´

5´

3´

3´5´

5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体目录5´3´载体DNA5´3´目的基因限制酶或机械剪切限制酶4.人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

4.人工接头(linker)连接人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目录人工接头及其应用CCGAATTCG5´-EcoRⅠEco四、重组DNA分子导入宿主细胞1.转化◆转化(transformation)：质粒DNA分子导入细菌宿主，并使其获得新表型的过程。三种方法：转化、转染和感染。◆感受态细胞(competentcell)：指经过处理后变得更容易接受外源DNA的细菌细胞。如使用CaCl2处理E.coli细胞，可获得E.coli的感受态细胞。四、重组DNA分子导入宿主细胞1.转化◆转化(trans2.转染◆转染(transfection)：将重组DNA分子转入真核细胞的过程。◆转染细胞：接受了外源DNA分子的宿主细胞。◆稳定转染(stabletransfection)：进入宿主细胞的DNA分子整合到宿主细胞基因组中。◆瞬时转染(transienttransfection)：进入宿主细胞的DNA分子游离于宿主染色体之外。◆转染方法：常用磷酸钙法和脂质体法。2.转染◆转染(transfection)：将重组DNA3.感染◆感染(infection)：以病毒或噬菌体为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，感染适当的细胞，并在细胞内扩增，也称为转导(transduction)。3.感染◆感染(infection)：以病毒或噬菌体为载五、重组子的筛选与鉴定1.载体的抗药性标志抗氨苄青霉素基因(Ampr)抗四环素基因(Tetr)抗卡那霉素基因(Kanr)等2.载体抗药性标志插入失活选择◆一般选用含有两个以上抗药基因的载体，外源DNA插入其中一个抗药基因，并导致该基因失活。如pBR322质粒含有Ampr基因和Tetr基因(BamHI)。五、重组子的筛选与鉴定1.载体的抗药性标志抗氨苄青霉素基因(插入失活法)抗药性标记选择目录(插入失活法)目录3.α-互补法

(即蓝白斑筛选法)质粒↓α-肽(无半乳糖苷酶活性)α-肽＋ω-肽(半乳糖苷酶活性)宿主↓ω-肽(无半乳糖苷酶活性)X-galX(蓝色产物)+gal(半乳糖)3.α-互补法(即蓝白斑筛选法)质粒α-肽＋ω-肽宿主X-

α互补的检测α互补的检测组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体4.营养缺陷型的互补筛选组氨酸缺陷无组氨酸酵母咪唑甘油磷促进组氨酸合成λDNA重组体5.核酸分子杂交筛选◆通过原位杂交、Southern印迹和Northern印迹分析转化子。根据插入序列设计探针与转化子克隆进行杂交有杂交信号的为阳性克隆5.核酸分子杂交筛选◆通过原位杂交、Southern印6.PCR法进行鉴定根据插入序列设计PCR引物以转化子的重组DNA为模板进行PCR扩增电泳分析PCR产物根据PCR产物长度判断阳性克隆，还可结合PCR产物测序进行更精确的分析6.PCR法进行鉴定根据插入序列设计PCR引物以转化子的重7.DNA序列分析鉴定◆直接进行DNA测序，精确分析阳性克隆。◆对阳性重组转化子的精确鉴定一般先选择前6种方法之一进行初步分析后，再进行DNA测序分析。7.DNA序列分析鉴定◆直接进行DNA测序，精确分析阳性第四节外源基因的蛋白质表达Section4ExpressionofRecombinantGene第四节◆重组基因表达体系的创建过程包括：表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离、纯化等技术。◆根据宿主细胞的不同可分为：原核表达体系真核表达体系◆重组基因表达体系的创建过程包括：◆根据宿主细胞的不同可一、原核表达体系1.不同表达方式的优缺点(1)非融合型表达

◆优点：与真核生物体内蛋白质结构最相似，功能最相近。◆缺点：容易被细菌蛋白酶所破坏。(2)融合型表达◆优点：可以抵御细菌蛋白酶的破坏，融合蛋白比天然的外源蛋白更加稳定一、原核表达体系1.不同表达方式的优缺点(1)非融合型表◆缺点：需要去除原核多肽。◆原核多肽切除方法：化学裂解法和酶解法。(3)分泌表达◆优点：防止大肠杆菌对表达产物的降解，减轻大肠杆菌代谢负荷和恢复表达产物天然构象。◆缺点：需要去除原核多肽。(3)分泌表达◆包涵体益处：防止蛋白酶对表达蛋白的降解，有利于表达产物分离纯化。◆包涵体缺点：表达蛋白不具有生物活性，必须溶解包涵体并对表达蛋白进行复性。2.包涵体(inclusionbody)◆是大肠杆菌高效表达外源基因时形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与细胞质中的其他成分有明显的区别。◆包涵体益处：防止蛋白酶对表达蛋白的降解，有利于表达产物分二、真核表达体系1.酵母表达体系

(1)酵母表达体系具有诸多优点：①可以对蛋白进行多种翻译后修饰②培养简单③自身分泌蛋白少，是理想的分泌型表达系统④具有较高的安全性，如啤酒酵母表达体系⑤分离纯化的过程比较简单(2)酵母表达体系实例干扰素、人表皮生长因子、人乙型肝炎表面抗原和核心抗原等。二、真核表达体系1.酵母表达体系①可以对蛋白进行多种翻译2.哺乳动物细胞表达体系

◆优点：①可表达克隆的cDNA，也可表达真核基因组DNA。②表达蛋白可被适当修饰。◆缺点：①操作技术难②费时③成本高2.哺乳动物细胞表达体系◆缺点：三、重组蛋白质分析鉴定检查内容分析方法鉴定标准分子量SDS银染一条带等电点等电点聚焦电泳银染一条带，扫描95%以上纯度HPLC层析一个峰(95%以上)WesternBlot有一条活性蛋白带结构分析氨基酸组成分析各种氨基酸比例符合设计氨基酸序列分析N-末端15个氨基酸符合要求肽谱图符合定点降解生物学活性细胞或动物实验符合比活性和特定生物学检测指标重组蛋白质的鉴定方法及标准三、重组蛋白质分析鉴定检查内容分析方法鉴定标准分子量SDS-四、重组蛋白质药物制备◆生物制药领域的上游技术包括基因克隆、表达载体构建与表达；下游技术包括蛋白质的分离纯化。◆重组胰岛素是第一个投放到市场的重组蛋白质药物。◆胰岛素的重组表达以礼莱(Lilly)公司的E.coli表达体系和诺和诺德(NovoNordisk)的酵母表达系统为代表。四、重组蛋白质药物制备◆生物制药领域的上游技术包括基因克隆本章小结：1.重组DNA技术、广义遗传工程和狭义遗传工程、克隆、限制性内切酶、Ⅱ型限制酶。2.

载体、载体的条件、克隆载体（质粒载体pBR322的特点）、表达载体（原核表达载体、酵母表达载体的结构特点与表达特点）。3.重组DNA操作的基本过程4.重组子的筛选和鉴定（载体的抗药性筛选，载体抗药性标志插入失活选择，α-互补法或蓝白斑筛选，营养缺陷性的互补筛选）本章小结：演讲完毕，谢谢观看！演讲完毕，谢谢观看！第十八章重组DNA技术Chapter18TechniquesofRecombinantDNA第十八章重组DNA技术◆DNA分子体外重组技术和核苷酸序列分析技术标志了基因工程时代的诞生。◆1973年，HerbertBoyer和StanleyCohen首次成功实现DNA分子的体外重组。◆1977年，FrederickSanger和WalterGilbert发明了DNA测序法。◆重组DNA技术(recombinantDNAtechnique)：指在体外重新组合DNA分子，并使它们在适当的细胞中增殖的遗传操作。◆DNA分子体外重组技术和核苷酸序列分析技术标志了基因工程◆遗传工程(GeneticEngineering)：借助生物学技术，对生物遗传物质进行更改和/或重新组合，以改变生物的遗传性状或创造新的生物品种的遗传学研究技术。◆遗传工程有广义和狭义之别，狭义遗传工程专指重组DNA技术(即基因工程)，广义遗传工程包括细胞水平的遗传操作(也称细胞工程)和基因工程。◆克隆：是英文“clone

”或“cloning

的音译，源于希腊文“Klone”，本意为无性繁殖系，即通过无性繁殖而产生的完全相同的子代集合体。◆遗传工程(GeneticEngineering)：借助重组DNA技术的基本步骤

重组DNA技术的基本步骤第一节重组DNA技术中的酶Section1EnzymesinDNARecombination第一节酶功能限制性核酸内切酶识别特异性核苷酸序列切割DNADNA连接酶催化相邻DNA片段的3'末端与5'末端生成磷酸二酯键DNA聚合酶催化合成DNA分子反转录酶以RNA为模板，催化合成cDNA碱性磷酸酶切除末端磷酸基末端转移酶在3'-羟基末端进行多聚物加尾多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5'-羟基末端磷酸化，或用来标记探针重组DNA技术中常用工具酶酶功能限制性核酸内切酶识别特异性核苷酸序列切割一、限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)1.定义◆限制性内切酶：又称限制性核酸内切酶，能识别结合双链DNA分子中的特异序列，并切割DNA。2.命名

◆由三个斜体字母组成：EcoRI来源菌属名(Escherichia)的第一个字母菌的种名(coli)R来自菌株名罗马数字(I)代表该酶被发现的次序5'···GGATCC···3'3'···CCTAGG···5'BamHI5'···GGATCC···3'3'···CCTAGG···5'一、限制性核酸内切酶(restrictionenzyme3.限制酶的分类根据作用特征可以分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三种类型

(1)三型限制酶的基本特征◆Ⅰ型：具有内切酶和甲基化酶的双重活性，作用需ATP供能，能识别和结合于特定的DNA序列位点，但随机切断在识别位点以外的DNA序列（通常在识别位点周围400~700bp）。◆Ⅲ型：具有内切酶和甲基化酶的双重活性，作用需ATP供能，切割位点距离识别位点约25bp。3.限制酶的分类◆Ⅰ型：具有内切酶和甲基化酶的双重活性，(2)Ⅱ型限制性核酸内切酶◆只由一条肽链组成，不具有甲基修饰酶活性，不需要ATP◆识别位点一般为4~6碱基对组成的特异性序列。◆切割后可产生粘性末端，也可产生平头末端。5'突出的粘性末端5'···GGATCC···3'3'···CCTAGG···5'5'···GGATCC···3'3'···CCTAGG···5'BamHI(2)Ⅱ型限制性核酸内切酶◆只由一条肽链组成，不具有甲5'···GAGCTC···3'3'···CTCGAG···5'5'···GAGCTC···3'3'···CTCGAG···5'SstI3'突出末端5'···GAGCTSmaI5'···CCCGGG···3'3'···GGGCCC···5'5'···CCCGGG···3'3'···GGGCCC···5'平头末端SmaI5'···CCCGGG···3'3'··二、DNA连接酶(DNAligases)◆常用的连接酶为T4连接酶，既可以连接粘性末端，也可以连接平头末端。◆温度是影响连接反应效率的重要因素，通常在4~26℃进行连接反应。二、DNA连接酶(DNAligases)◆常用的连接酶为不同类型的限制性内切酶的切点性质以及粘端之间的退火不同类型的限制性内切酶的切点性质以及粘端之间的退火第二节载体Section2Vectors第二节载体◆DNA载体：是指具有接受外源DNA片段并能导入宿主细胞进行自主复制的特定DNA分子。◆克隆载体用于克隆基因或DNA片段的载体。◆用于表达一个基因则称为表达载体。◆载体的特点：(1)含有复制起始点(2)体积小◆DNA载体：是指具有接受外源DNA片段并能导入宿主细胞进(3)不能插入到基因组中，易于分离和纯化(4)含有选择性标记(5)含有克隆位点(5)具有适当的长度◆表达载体则除了上述特征外，还应在所要表达的基因上游具有转录启动子，下游有转录终止子等；很多表达载体还具有核糖体结合位点。(3)不能插入到基因组中，易于分离和纯化◆表达载体则除了一、克隆载体1.质粒载体◆通常为天然质粒的人工改良DNA。

(1)pBR322为最早发展的常用克隆载体之一，具有如下特点：①带有一个复制起始位点②具有Ampr和Tetr二个抗性基因，可插入失活③具有较小的分子量(4.36kb)④可插入较大外源片段(~6kb)⑤拷贝数较高(可达1000~3000)一、克隆载体1.质粒载体为最早发展的常用克隆载体之一，具有质粒pBR322示意图质粒pBR322示意图(2)pUC系列质粒◆由pBR322改建而成，主要特征为：①有复制起始位点(ori，源于pBR322)②Ampr基因(酶切位点不再单一)③含有LacZ'基因④含有多克隆位点区段◆pUC系列大多数是成对的，如pUC8/pUC9、pUC18/pUC19(2)pUC系列质粒①有复制起始位点(ori，源于pBRpUC18/19质粒的基本结构pUC18/19质粒的基本结构◆

pUC系列质粒的优点：①具有更小的分子量和更高的拷贝数②适应于组织化学筛选重组体(蓝白斑实验)③pUC系列提供多克隆位点(MCS)2．噬菌体载体◆常用于大片段DNA的克隆，实验中以λ噬菌体、M13和粘粒最为常用◆pUC系列质粒的优点：2．噬菌体载体◆常用于大片段DN3.人工染色体◆人工染色体(artificialchromosomes)：由染色体的复制元件构建的载体，是为克隆更大片段的DNA而发展的新型载体。◆人工染色体主要包括三种：细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)和哺乳动物人工染色体(MAC)◆YAC载体的复制元件包括：复制起点序列(即自主复制序列，ARS)、着丝粒(centromere,CEN)和两个端粒(TEL)。3.人工染色体◆人工染色体(artificialchr二、表达载体根据表达载体的结构特点：原核表达载体酵母表达载体昆虫细胞表达载体哺乳动物细胞表达载体植物细胞表达载体等二、表达载体根据表达载体的结构特点：1.原核表达载体(1)原核表达载体的结构特点：①强启动子常用启动子：Lac启动子、Trp启动子、T7噬菌体启动子②转录终止子：T7终止子等③SD序列：提供核糖体的结合位点1.原核表达载体(1)原核表达载体的结构特点：(2)

原核表达载体表达特点：①非融合型表达蛋白②融合型表达蛋白③分泌型表达蛋白(2)原核表达载体表达特点：XhoI(158)NotI(166)EagI(166)HindIII(173)SalI(179)SacI(190)EcoRI(192)BamHI(198)NheI(231)NdeI(238)NcoI(296)T7Promoter(370-386bp)T7Terminator(26-72bp)XhoI(158)T7PromoterT7TerminT7启动子Lac操纵序列rbs(SD序列)T7终止子MCSNcoI(CCATGG)His标签His标签凝血酶位点pET-28a-c(+)克隆表达区结构特征T7启动子Lac操纵序列rbsT7终止子MCSNcoI(HindIIIKpnISacIBamHIBstXIEcoRIBstXINotIXhoISphIXbaI2.酵母表达载体◆一般为质粒型穿梭载体。酵母表达载体pYES2HindIII2.酵母表达载体◆一般为质粒型穿梭载体。①选择性标志◆通常利用营养缺陷型突变作为筛选的标记，如常用的：URA3、LEU2、HIS3和TRP1。②复制子◆通常利用啤酒酵母2μm环质粒的复制起始序列。③常用的启动子◆常用的酵母基因启动子：醇脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、蔗糖酶、酸性磷酸酯酶和酵母交配因子(MFα)。(1)酵母表达载体的结构特点①选择性标志◆通常利用营养缺陷型突变作为筛选的标记，如常④上游活性序列◆上游活性序列的功能类似于增强子，可促进转录。⑤终止序列◆可终止转录，还可增加mRNA的数量和蛋白质表达的总量。⑥特定蛋白结构域◆如信号肽序列和核定位序列等。④上游活性序列◆上游活性序列的功能类似于增强子，可促进转(2)酵母表达载体的表达形式①直接表达②分泌性表达◆外源蛋白质表达后积累于酵母细胞质中，如人乙型肝炎表面抗原的表达。◆外源蛋白质表达后在信号肽指导下分泌至细胞外，信号因子通常为α因子前导序列，Invitrogen公司的酵母表达载体pGAPZα属于此种类型。(2)酵母表达载体的表达形式①直接表达②分泌性表达◆3.哺乳动物表达载体◆哺乳动物细胞表达外源蛋白的优势是可被修饰。◆常用的哺乳动物细胞表达宿主：中国仓鼠卵巢细胞(CHO)

猴肾细胞(COS)等◆哺乳动物细胞表达载体一般为穿梭型载体，含有真核细胞表达相应序列，如Invitrogen公司开发的pcDNA3.3-TOPO。3.哺乳动物表达载体◆哺乳动物细胞表达外源蛋白的优势是可哺乳动物表达载体pcDNA3.1哺乳动物表达载体pcDNA3.1第三节重组DNA操作的基本过程Section3ProtocolsofDNARecombination第三节DNA重组的基本过程：

1.靶基因DNA片段的制备

2.适宜载体的选择和制备

3.DNA片段与载体的连接

4.重组DNA转化宿主细胞

5.含有重组DNA宿主菌的筛选

6.重组DNA分子的鉴定DNA重组的基本过程：基因组DNA质粒载体限制酶目的基因序列重组后含有外源基因的载体DNA连接酶基因组DNA质粒载体限目的基因序列重组后含有外源基因的载体D转化扩增转化扩增重组DNA技术的基本步骤

重组DNA技术的基本步骤一、目的DNA片段的制备◆来源与方法：基因组DNA、cDNA、PCR产物和化学合成的DNA。◆基因文库(genelibrary)：也称基因组文库(genomelibrary)，用限制酶切割基因组DNA获得成千上万的在一定大小范围内的DNA片段，每一个DNA片段与载体分子连接，产生一个重组DNA分子的混合物，重组DNA分子转化宿主菌后，每一个转化细胞含有一个重组DNA分子，这些克隆的集合体被称为基因文库。一、目的DNA片段的制备◆来源与方法：基因组DNA、cDN基因组文库的构建基因组文库的构建◆

cDNA文库(cDNAlibrary)：提取细胞总mRNA，经反转录获得总cDNA，每一个cDNA分子与载体连接产生了一个重组DNA分子的混合物，再转化宿主菌，每个宿主菌细胞克隆将含有一个cDNA重组分子，这些克隆的集合体被称为cDNA文库。◆

若目的序列全部已知，可以通过人工合成的方法获取靶序列。◆

已知目的序列两端序列时，可以通过PCR方法获取靶序列。◆cDNA文库(cDNAlibrary)：提取细胞总mRcDNA文库的构建cDNA文库的构建二、载体的选择与准备◆选择原则：依据重组DNA的目的，选择适当载体。适合的选择标记克隆载体表达载体细菌载体酵母载体昆虫细胞载体哺乳动物细胞载体二、载体的选择与准备◆选择原则：依据重组DNA的目的，选择三、DNA分子的体外重组◆互补性粘性末端将使连接更容易。限制酶粘性末端连接T-载体粘性末端连接平末端连接同聚物加尾连接人工接头连接三、DNA分子的体外重组◆互补性粘性末端将使连接更容易。限BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连限制酶粘性末端连接目录BamHⅠ切割反应GGATCCT4DNA连接酶GATC目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目录平末端链接目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶重组体3.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。3.同聚物加尾连接5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶

5´3´

3´5´

5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´

5´

3´

3´5´

5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体目录5´3´载体DNA5´3´目的基因限制酶或机械剪切限制酶4.人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

4.人工接头(linker)连接人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目录人工接头及其应用CCGAATTCG5´-EcoRⅠEco四、重组DNA分子导入宿主细胞1.转化◆转化(transformation)：质粒DNA分子导入细菌宿主，并使其获得新表型的过程。三种方法：转化、转染和感染。◆感受态细胞(competentcell)：指经过处理后变得更容易接受外源DNA的细菌细胞。如使用CaCl2处理E.coli细胞，可获得E.coli的感受态细胞。四、重组DNA分子导入宿主细胞1.转化◆转化(trans2.转染◆转染(transfection)：将重组DNA分子转入真核细胞的过程。◆转染细胞：接受了外源DNA分子的宿主细胞。◆稳定转染(stabletransfection)：进入宿主细胞的DNA分子整合到宿主细胞基因组中。◆瞬时转染(transienttransfection)：进入宿主细胞的DNA分子游离于宿主染色体之外。◆转染方法：常用磷酸钙法和脂质体法。2.转染◆转染(transfection)：将重组DNA3.感染◆感染(infection)：以病毒或噬菌体为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，感染适当的细胞，并在细胞内扩增，也称为转导(transduction)。3.感染◆感染(infection)：以病毒或噬菌体为载五、重组子的筛选与鉴定1.载体的抗药性标志抗氨苄青霉素基因(Ampr)抗四环素基因(Tetr)抗卡那霉素基因(Kanr)等2.载体抗药性标志插入失活选择◆一般选用含有两个以上抗药基因的载体，外源DNA插入其中一个抗药基因，并导致该基因失活。如pBR322质粒含有Ampr基因和Tetr基因(BamHI)。五、重组子的筛选与鉴定1.载体的抗药性标志抗氨苄青霉素基因(插入失活法)抗药性标记选择目录(插入失活法)目录3.α-互补法

(即蓝白斑筛选法)质粒↓α-肽(无半乳糖苷酶活性)α-肽＋ω-肽(半乳糖苷酶活性)宿主↓ω-肽(无半乳糖苷酶活性)X-galX(蓝色产物)+gal(半乳糖)3.α-互补法(即蓝白斑筛选法)质粒α-肽＋ω-肽宿主X-

α互补的检测α互补的检测组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体4.营养缺陷型的互补筛选组氨酸缺陷无组氨酸酵母咪唑甘油磷促进组氨酸合成λDNA重组体5.核酸分子杂交筛选◆通过原位杂交、Southern印迹和