基因工程课件

第八章基因工程

（GENETICENGINEERING）1第八章基因工程

（GENETICENGINE本章，我们讨论4个问题：1.什么是基因工程——基因工程的概念。2.为什么能进行基因工程——基因工程的原理和技术。（包括3大理论和3大技术准备）3.怎样进行基因工程——3大步骤（DNA体外重组，重组DNA导入宿主细胞后扩增和表达，基因工程后处理）4.基因工程的应用和前景——对于医学来说即生产基因工程产品、开展基因治疗等。2本章，我们讨论4个问题：2第一节概述一.现代科学技术发展的3个特点：

（一）科学技术加速发展和急剧变革：1.当代科学发展成指数增长趋势，全世界发表科技论文6000－8000/天，平均1篇/10.8秒问世。2.人类科技知识在19世纪半衰期是50年，现在是3－5年（终身教育学习）。

3.1973年，CohenGroup第一次实现了细菌遗传性状的转移terr+nersr→terrner，导致基因工程技术诞生，至今不到30年，人类已经拥有了克隆羊、猪等等的技术，可以复制一个生命体。（克隆羊多利1997－2003，体细胞克隆，胚胎细胞克隆）3第一节概述一.现代科学技术发展的3个特点：PscloltetrRb-3nersrtetrnertetr

nerOtetrne图8-1CohenGroup第一次实现了细菌遗传性状转移示意图4PscloltetrRb-3nersrtetrnertet(二)科学技术发展的综合化

1.19世纪中叶，以科学技术是分离的，它们各有独自文化传统，它们的发展往往是脱节的。2.科学回答“是什么”“为什么”，技术回答“做什么”“怎么做”。当今科技发展已经密不可分，科学里包含技术，技术里体现科学。3.当代科技发展有两种形式：一是突破，二是融合。突破是线性的，即从研究开发新一代的科技成果取代原有一代科技成果。融合是非线性的，即混合原有不同的科技领域，进而发展新产品，造成革命性市场，它们是互补和合作的结果。基因工程既是科学又是技术，既是突破，又是融合。她造成革命性市场（美国基因工程产品300亿美元/年，乙肝疫苗50美元/人）；她是分子遗传学，生物化学，细胞学，细胞生物学，分子生物学相互渗透，交叉融合、突破的结果。5(二)科学技术发展的综合化5(三)科技发展必需和人文社会科学发展相结合：

1.当代各种全球性问题出现，从一定意义上来说是由于科学技术广泛应用于社会而引发的，如TMD、NMD(布什对萨达姆)2.科学技术是第一生产力，而文化水平是人类把握科学技术的一个尺度。3.科学技术是一把双刃剑，原子核技术可以给人类带来光明，原子弹却可以把长崎、广岛夷为平地；克隆技术，基因工程技术可以挽救濒临灭绝的动物（国宝熊猫），也可以动摇人类以性爱为基础的生产方式……（冷冰冰克隆人和自然人，×情人节少了一个经济增长点；克隆战争狂人和反战英雄；克隆idea孙悟空齐天大圣）。基因工程技术是当代科学技术重要的前沿。6(三)科技发展必需和人文社会科学发展相结合：6二．基因工程的概念（一）基因（gene）

基因从化学上来说，指的是一段DNA或RNA顺序，该顺序可以产生或影响某种表型（genotype，phenotype），可以由于突变生成等位基因变异体（体细胞父源和母源；正常和突变基因）；从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。（二）基因工程（geneticengineering）

基因工程

在体外通过人工剪、接，将不同来源的DNA分子组成一个杂合DNA分子(DNA分子重组体)，然后导入宿主细胞去复制扩增或表达。因为通过人工设计,得到一定的设计方案，故称为基因工程。由于整个操作在分子水平上进行，所以也称分子克隆。

基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达。

7二．基因工程的概念7

在这个过程中：1.“基因剪刀”

剪取DNA的酶就像一把“基因剪刀”2.“缝纫针”

连接不同来源DNA分子的酶就像一根“缝纫针”，使二者连在一起3.“交通工具”使用载体好比一辆车子

4.“乘客”

有用基因如IL2好比使乘客，车子把乘客送进理想天堂（宿主细胞）去繁衍生息，春华秋实，生产我们需要的产品或开展基因治疗（IL2/LAK→抗癌）。8在这个过程中：8

我们应该记住他们——1.第一个实现DNA重组的人－Berg1972年，Berg用E.coRⅠ切割SV40DNA和λphageDNA，经过连接组成重组的DNA分子。Berg是第一个实现DNA重组的人。2.第一个取得基因工程成功的人－Cohen

1973年，CohenGroup将E.coli的tetr质粒psclol和nersrR6-3质粒体外限制酶切割，连接成一个新的质粒，转化E.coli，在含四环素和新霉素的平板上筛选出了terrNer,实现了细菌遗传性状的转移。这是基因工程史上的第一个克隆化并取得成功的例子，这一年被定为基因工程诞生的元年。9我们应该记住他们——9三．基因工程克隆技术――人类对自然的干预（一）遗传和变异是生物学的一对重要概念。

1.遗传赋予生物种的稳定，保证生物种的延绵不断（不能断香火）。2.变异赋予生物种的进化，保证生物种对环境的适应。3.遗传和变异这一对矛盾在一个生物体内统一起来。4.在生物演变的历史长河中，自然发生的变异是相当相当缓慢的。5.随着生物科学的发展，尤其是基因工程技术的诞生，人类开始干预生物的变异（福耶祸耶？无法定论）6.经典的遗传学千百万年才能积累出现的有利的变异，通过基因工程手段几十年乃至几年就可以实现。而时至今日，几乎一发不可收拾。10三．基因工程克隆技术――人类对自然的干预10(二)多利

1997．2．23．，Nature杂志报道，英国爱丁斯堡罗斯林研究所和PPL生物技术公司已经成功克隆了一只名叫多利的绵羊（1997－2003/7/12）。这一消息的公布，全世界震惊的程度不亚于原子弹在长崎和广岛的爆炸，在全球引起了轩然大波，以至世人惊呼：不要让科学疯狂！为什么以前胚胎克隆没有在世界上引起轩然大波呢?原因是此克隆非彼克隆，多利取自功能彻底分化的成年动物乳腺细胞，即体细胞。它推翻了遗传学上一条上百年的定律：体细胞功能高度分化，不可能重新发育成个体。11(二)多利11（三）多利诞生的过程

为什么震惊和惊呼，我们先了解一下多利诞生的过程以及胚胎细胞克隆和体细胞克隆的区别这两个基本问题，对我们学习后面内容或许有所帮助和启发。多利诞生的过程：1.取出第一只成年母羊乳腺的普通细胞，分离基因备用。2.取出第二只母羊未受精的卵细胞，取出基因换上第一只羊乳腺细胞基因（“掉包”），放电激活该卵细胞，使之象正常受精卵一样进行细胞分裂，直至一定阶段，胚胎成熟。3.将成熟的胚胎移植到第三只母羊子宫中发育，妊娠（同正常一样），最后产下多利。这样一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了。

12（三）多利诞生的过程12（四）此克隆非彼克隆

胚胎细胞克隆体细胞克隆供体细胞胚胎细胞（核）体细胞（核）受体细胞去核未受精的卵细胞去核未受精的卵细胞发育场所母体宫腔母体宫腔关键区别克隆的是子代（多生了一个）复制的是自己（复制了一个）（五）克隆是一把双刃剑

试想，有了克隆技术，有人在你毫不知晓的情况下复制一个“你”去犯罪，怎么办？试想，有了克隆技术，一些极权的政治野心家一下子克隆出好几个战争狂人希特勒、墨索里尼，怎么办？还有，有了克隆技术，世界上同时生活着多个你、我、父母、兄弟、姐妹，按现行的社会伦理道德很难为其“名份”定位，又该怎么办？因此说克隆对人类社会伦理道德提出了一场非同寻常的挑战，平添一系列是我非我、是父非父、是妻非妻、是子非子之类的麻烦事，绝非危言耸听。从社会伦理角度看，用克隆技术培育出的人，有其特定的生理性状，这对人类的自然发展和人种的自然构成无疑会产生极大的影响。13（四）此克隆非彼克隆（五）克隆是一把双刃剑试

从家庭伦理角度看，将克隆技术用于人体繁殖，会加剧家庭多元化倾向，还会从根本上改变人的亲系关系，确定人类亲系关系的标准也将发生改变。从性伦理角度看，它完全改变了人类自然的基于性爱的生育方式，使人口的生产与性爱分离，从而破坏男女之间基于性受而获得后代的情感，并由此改变人类的基本性伦理关系。从遗传学上看，人本来是由两性细胞结合而产生的，这种结合有利于人种进化，而克隆使人的遗传基因成为单一的，势必导致人种退化。从哲学上看，克隆还会使人们正常的生与死的概念发生动摇。图8-2用克隆技术复制人类的假想图14从家庭伦理角度看，将克隆技术用于人体繁殖，四．基因工程3大理论，3大技术准备：（一）理论上的3大发现：1.20世纪40年代，Avery发现了生物遗传物质的化学本质是DNA。超越时代的科学成就往往不易被人们接受，Avery当时并未赢得阵阵掌声，他的论文事隔10年以后才公开发表。2.20世纪50年代，Watson-crick提出了DNA结构的双螺旋结构模型，搞清楚了生物遗传物质的分子机制。3.20世纪60年代，确定了遗传信息的传递方式：DNA→RNA→Pr,破译了全部遗传密码，43。15四．基因工程3大理论，3大技术准备：15（二）技术上的3大发明：1．“基因剪刀”－限制性内切酶的发明

（1）20世纪40－60年代，科学家们就为基因工程设计了美好的蓝图，但是面对庞大的dsDNA（104，2.2*1011公里）束手无策，无从下手把它切成单个基因片断。（2）当时的酶学知识已有相当的发展，但是没有一个已发现的酶能完成这样的使命。（3）1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌（Haemophilusinffuenzae）分离纯化了HindⅡ，取得了突破，打破了基因工程的禁锢，迎来了改造生物的春天，为基因工程奠定了最为重要的技术基础。16（二）技术上的3大发明：162．载体(“交通工具车子”)－基因工程技术诞生的第二个技术准备

（1）

有了切割与缝合（ligase）基因DNA的工具，还得有一个车子（富康）将重组DNA送到宿主细胞中去。（2）1946年起，Lederberg就研究细菌性因子（F因子）.50-60年代相继发现了R因子（抗药因子），CoE(大肠杆菌因子)等质粒。（3）然而，直到1973年Cohen才能将质粒作为基因工程载体使用（至今一直是基因工程最重要最广泛使用的载体）。这是基因工程的第二个技术准备。172．载体(“交通工具车子”)－基因工程技术诞生的

3．逆转录酶－1970年Baltimove和Temin等同时各自发现了逆转录酶，打破了遗传学（生物学）中心法则，使真核基因的制备成为可能。（原因如下）(1)真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。HGP2005年完成，2.8万个基因，1－3kb/基因，104，2.2*1011公里。（2）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能在原核表达系统剪接出mRNA，没有成熟的mRNA就不能得到相应得产物。（3）经过逆转录mRNA→cDNA(complementoryDNA)文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克隆就方便得多。有了这些理论核技术的武装，基因工程的临盆降生指日可待，Berg和Cohen两位科学的“助产士”，把基因工程接到了人间。183．逆转录酶－1970年Baltimove和Te五．与基因工程相关的概念：（一）克隆（clone,cloning）：

1.原意是指单细胞纯系无性繁殖。2.现代概念是将实验得到的人们所需的微量基因结构，引入适当的宿主细胞中去。在合适的生理环境中进行无性繁殖，从而利用宿主的生理机制繁衍人们所需要的基因结构，并进行表达。由于整个操作在分子水平上进行，所以称为分子克隆（molecularcloning）。3.

这个术语的几种含义：

（1）作为名词

①带有相同插入顺序的重组DNA分子的1个群体。②基因型（genetype）相同的细胞或生物体的一个群体。③最常用的是描述一个微生物的一个菌落，这些微生物带有插入了特定DNA片断的载体分子。

（2）作为动词，是“去克隆”，即利用体外DNA重组技术将一个特定的基因或DNA顺序插入一个载体分子。19五．与基因工程相关的概念：19

（二）重组DNA技术(DNArecombinationtechnique)

是用酶学的方法将不同来源的DNA在体外切割，连接组成一个杂合的DNA分子的技术。基因工程包括DNA重组技术，现将相关的概念关系列表如下。

（三）生物工程（Biologicengineering）：是更大范围内生产及产品的工程技术，是现代生物学中一切工程技术的总称，包括：

1.遗传工程（geneticengineering）

比较基因工程有更广泛的内容，包括基因工程，但基因工程不等于遗传工程，凡是人工改造遗传性状的技术都称之遗传工程，有个体的，细胞的，分子水平的。

（1）基因工程：①DNA重组；②DNA体外诱变；③体外基因操作；④基因化学合成等。（2）物理化学诱变；（3）细胞融合（4）花粉培育（5）有性杂交等。

2．发酵工程3．酶学工程4．细胞工程5．农业工程6．希望工程20（二）重组DNA技术(DNArecombination第二节工具酶常用的工具酶（toolenzymes）有：

1.限制性核酸内切酶（resrictionenzymes,restrictionendonadease)2.DNA连接酶（DNAligase,ligase)3.逆转录酶(reversetranscriptase)4.DNA聚合酶(DNApolymerase,DNApol)5.核酸酶(nuclease)6.末端转移酶(terminaltransferase)7.碱性磷酸酶(BAP或CIP)以1.和2.最为常用，最为重要。工具酶现已商品化。21第二节工具酶常用的工具酶（toolenzym一．限制性核酸内切酶（一）限制酶的概念（定义，分类，命名，限制与修饰辨正关系）1.定义限制酶（restrictionendonuclease,restrctionenzymes）是一类专门切割DNA的酶，它们能特异结合一段被称为限制酶识别顺序的特殊DNA序列。并切割dsDNA。所谓限制（restriction）=切割（clearage）=水解（hydrolysis）该部位的核苷键（磷酸二酯键）2.分类限制酶都是从原核生物中发现的（400多种E/350M）。所有的限制酶可分成3类。

（1）Ⅰ、Ⅲ型，兼具限制与修饰活性，它们识别与切割顺序不在一个地方，不产生特异性的DNA片段，与基因工程意义不大（有说Ⅲ型识别核切割的位点一致，但罕见）。

（2）Ⅱ型基因工程说到的限制酶是Ⅱ型酶，具有此类酶的微生物限制－修饰系统分别由限制酶核甲基化酶来完成。Ⅱ型酶分子量小，仅需Mg2＋作为催化反应的辅因子，识别与切割位点相同，产生特异的DNA片段。22一．限制性核酸内切酶223.

命名（1973年Smith原则、Ⅱ型酶）根据分离此酶微生物的学名，一般取3个字母。第一个字母大写该微生物属名前的第一个字母第二、三个字母小写该微生物种名前的2个字母第四个字母大写有变种或品系的第一个字母罗马字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ从一种微生物中发现了几种限制酶，按发现顺序排列

如EcoRⅠ是指从大肠杆菌（Escherichiacoli）R株分离得到的第一种限制酶。233.

命名（1973年Smith原则、Ⅱ型酶）23

(二)限制酶的识别位点1．

一般特征（4点）：（1）Ⅱ型酶识别的特殊DNA序列称为限制酶的识别位点（或切割位点）。

（2）它能识别dsDNA的4－6bp的回文序列并水解该部分的核苷键。一般来说是4－6bp，有6个以上的，但没有4个以下的。（3）识别顺序呈二重对称，即1800旋转对称。如：

GCCGGTNACGAATTCHhaCGGCMaeⅢCANTGEcoRⅠCTTAAG(4)酶靶顺序大小是很重要的，它决定产生特定DNA中段的大小。若DNA碱基组成是均一的，限制酶切点是随机的，那么对于：①

要求4bp靶序列如HpaⅡ,MboⅠ等在庞大DNA链上平均44核苷酸即可遇到一个靶序列，即1/256②

同理，要求6bp的酶，则平均46遇到一个靶序列，即1/4096。24(二)限制酶的识别位点24

2.识别简并序列;

简并序列是指序列中有核苷酸位可以是不同的核苷酸。如：GTYRACY=C或TR=G或AYR=CG或CA或TG或TAHinⅡ实际上可以识别4个特定序列。3.识别位点与切割位点不同，但二者距离是一定的(某些酶识别位点在切割位点附近),即产生特定的DNA片段，这是与Ⅰ型酶的区别之一。

HgaⅠ识别位点GACGC→5/10(核苷酸距离)→dsDNA上切割5ˊGACGCNNNNN↓NNNNN3ˊ3ˊCTGCGNNNNNNNNNN↑5ˊ先识别（搞清楚）滑行一段距离再切，此称为Distantcleavage

252.识别简并序列;25

(三)限制酶的切割位点：限制性对dsDNA2条链同时切割（其具体切割点，即磷酸二酯键断开的位点，相对二重对称轴的位置而异）产生3种不同切口：1．

形成平头末端（flush或bluntend）如－TC↓GA-smaⅠbsuRⅠor–TC3ˊ+5ˊGA-－AG↓CT-AluⅠ-AG5ˊ+3ˊCT-2.形成5′－粘性末端（5′－cohesiveend即3′延伸末端）5′-GAATTC3′EcoRⅠ5′-GAATTC-3′+3′-CTTAAG5′3′-CTTAAG-5′3.形成3′－粘性末端（3′－cohesiveend）5′CTGCAG3′pstⅠG-3′5′-CTGCA+3′GACGTC5′ACGTC-5′3′-G粘性末端（stickyend）—限制酶切割产生2个突出的末端称之，作用是放在一起自发形成双链。26(三)限制酶的切割位点：26（四）同裂酶(isoschizomers)

通常不同的酶识别不同的顺序，然而有许多不同源限制酶产生相同的末端，此即同裂酶。1．异源同工酶（Isoschizomers:来源不同，识别顺序相同，切割方式可同可不同：(1)识别顺序与切割方式同，如：MboⅠ5′和SauSⅠ3′（－NN↓GATCNN-3′）-NNCTAG↓NN-5′(2)识别顺序同，切割位点不同，如：SmaⅠ和XmaⅠCCC↓GGGC↓CCGGG(3)识别与切割相同，但其中一酶可以切“修饰”（甲基化*），另一酶不能。如：HpaⅡ→CCGGMspⅠ→CCG*GMboⅠ→GATCSau3A→GA*TC2.一个位点包含在另一个位点之中（称subsets-识别与切割相互有关的酶称之。）

HpaⅡCC↓GGSmaⅠ的6个bp含HpaⅡ的4个bp顺序，所以HpaⅡSmaⅠCCC↓GGG能识别与切割SmaⅠ的6个bp，但含有HpaⅡ的ccgg其它6核苷酸顺序都不能被SmaⅠ切割。3．同尾酶（isoaudumers-识别顺序不同，产生粘性末端相同的酶称之。）

BamHⅠG↓GATCC由此产生的DNA片段可借粘性末端相互连接，Sau3AN↓GATCN在DNA重组时具有更大的灵活性。27（四）同裂酶(isoschizomers)27

(五)限制酶得正常识别切割能力是buffer的或几个因子的函数（1－8等）

1.酶浓度2.酶的专一性3.离子浓度4.pH5.温度6.底物浓度、纯度7.2价离子：Mg2+、Mn2+、Co2+、Zn2＋8.保护剂：甘油、DMSO、甲酰胺Polisky证明，Mgcl2从5mM下降至2mM，pH值上升到8.5，EcoRI专一性从6bp下降至4bp即NAATN,这种识别AATT的EcoRI称EcoRI*。一种限制酶可能被它识别位点的甲基所抑制，这对于组建DNA甲基化图谱是很重要的，是研究一个动向。对于限制反应机制，尽管书上列出1，2步反应，但人们更关注他的应用。所以这方面资料极少（全球1－2人）。（六）限制酶的应用：

1．DNA重组2.分子杂交受体体段DNA3.DNA序列分析4.制备DNA指针5.基因定位,DNA7.DNA甲基化碱基的识别和切割8.组建新质粒28(五)限制酶得正常识别切割能力是buffer的或几个因子的DNA物理图谱——标明限制酶在DNA分子上的限制位点数，限制性片段的大小及排列顺序的图谱称之或称限制性图谱。组建图谱是基因工程的第一步工作（很难，拿来主义多，受惠赠，千万注意要图谱，不要受骗），与基因定位，转录，消化，分离，分子杂交，克隆转化有直接的关系。29DNA物理图谱——标明限制酶在DNA分子上的限制二．DNA连接酶：DNA连接酶是基因工程第二位重要的工具酶，常用T4DNAligase.（一）功能：催化有互补顺序的两个dsDNA分子的粘性末端或平头末端3′－OH、5′－P连接作用。（二）来源－噬菌体T4感染Ecoli分离的一种单链多肽酶、MW.68KD。（三）催化反应：

（1）需要ATP、Mg2+作辅助因子；（2）缺刻（Nick）DNA也可作该酶的底物。（3）对粘性末端催化活性大于平头末端（酶量1：100）30二．DNA连接酶：30三、逆转录酶（一）概述

逆转录酶也称反转录酶或RNA依赖的DNA聚合酶（RNAdependentDNApolymerase,RDDP）。是由Baltimove从鼠白血病病毒（murineleukemiavirus,MLV）和Mizutan从劳氏肉瘤病毒(Roussarcomavirus,RSV)中，于1970年分别各自发现的，这两个小组论文同时在同一期Nature上，可见其意义。该酶在逆转录病毒（retrovirus）生产循环中起主宰作用。（二）功能基因工程中主要用于逆转录mRNA→cDNA（complementoryDNA）。（三）商品化逆转录酶有两种

①AMV（禽成髓细胞瘤）②Mc-MLV(鼠白血病病毒)。31三、逆转录酶31（四）酶的活性

由于尚不完全清楚原因，sscDNA能形成发夹结构，引导EcoliDNApolⅠkelnow片段或录酶合成cDNA第二条链，（多年来除了自身引导合成cDNA第二条链外别无它法）。逆转录酶是一种多功能酶，它的酶活性有：1.逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA2.DNA依赖DNApol以ssDNA为模板，3′－OHDNA片段为引物，按5′→3′合成DNA链。3.

RnaseH外切RNA酶活性，底物是RNA－DNA杂交分子RNA链，有两种：①5′→3′外切RNA，称5′→3′外切RNA酶；②3′→5′外切RNA酶，称3′→5′外切RNA酶，也称RnaseH。4.DNA内核酸酶Mn2＋存在时，逆转录酶能切cccDNA，此活性无专一位点，对热不稳定。5.

DNA解旋酶类似unwinding。32（四）酶的活性32四、DNA聚合酶：

DNA聚合酶以DNA为模板合成DNA，基因工程常用的酶有：（一）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（E.coliDNApolⅠ）

1956年，A.kornberg首先从E.coli中分离得到。是由1条多肽链组成的球蛋白直径65，MW109KD，并以蛋白敏感的多肽接头折叠成两个区域含19－45％а螺旋结构，分子中有单链巯基，每分子含1个Zn2＋原子，还不能证明Zn2＋参加了催化反应，酶活性中心有3个密切相连的结合位点－即DNA核模，核苷磷酸（估计引物，生长链痘结合在这里）和dNTP结合位点。1．E.coliDNApol由大小两亚基组成，具有3种酶活性，即大亚基5′→3′DNA聚合酶，3′→5′外切酶及小亚基的5′→3′外切酶活性：（1）5′→3′DNA聚合酶活性以ssDNA为模板，沿引物3′－OH方向，按模板顺序从5′→3′延伸。5′CCGATA－OHE.coliDNApolⅠ5′CCGATAGCCT3′3′GGCTATCGGA5′Mg2＋dDNP3′GGCTCGGA5′（2）3′→5′外切酶活性即从游离的3′－OH末端降解ssDNA或dsDNA，其意义在于识别和消除不配对的核酸，保证DNA复制的忠实性。其dsDNA外切活性可被5′→3′聚合活性所抑制。5’CGCATCG-OH3’E.coliDNApolⅠ5’CGC3’GCGMg2＋3’GCG＋dAdTdCdG其dsDNA外切酶活性可被5′→3′DNA聚合酶活性所抑制。（3）5′→3′外切酶活性：从游离的5’端降解dsDNA成单核苷酸或寡核苷酸，也降解DNA:RNA杂交体RNA成分（具有RnaseH活性）5’－CTCATTAG－3’E.coliDNApolⅠ5’－CATTAG3’－GCGTAATC－5’Mg2＋3’－GCGTAATC+pC,pG33四、DNA聚合酶：332.E.coliDNApolⅠ(DNApolⅠ)在基因工程的应用：

（1）制备高比活性的探针DNApolⅠ可催化DNA缺口移位反应（Nicktranslation），为基因工程制备高比活性放射性探针（放标，非放标，32P，地高辛6400.00/盒）5’――――――――3’3’――――――――5’dsDNAMg2＋↓DNA酶Ⅰ5’—3’（3’—5’）↓32PdNTP,DNApolⅠ（全酶）5’―3’3’―5’（参缺口平移法图解）（2）用于分子克隆（填充缺口利于重组）

DNApolⅠ能填充DNA的小缺口区（Gappedregion）→以便有效在体外用于DNA分子重组，如：①切割cccdsDNA分子作载体时②插入一段不具粘性末端的DNA片段或加入1个同源顺序ssDNA片段③此时用DNApolⅠ填充这个缺口④再用ligase(3’-OH,P-5′)连接，组成重组DNA分子。342.E.coliDNApolⅠ(DNApolⅠ)在基（3）DNA序列分析

DNApolⅠ是3种测测序法（Sanger双脱氧法（测序自动化原理同Sauger双脱氧法），化学降解法和加减法）中的关键试剂→每个方法的成败都取决于DNApolⅠ从融合引物复制的ssDNA的能力（详参DNA的序列测定），这里仅作简介。①

Sauger双脱氧法DNApolⅠ参入了2’3’－双脱氧核苷酸到相应的融合了的引物中，从而终止了链的进一步延伸，这样每个大小不同片段都带有ddNTP。经过PAGE测出DNA顺序。②

化学降解法当Mg2＋被Mn2＋取代时，DNApolⅠ有参与相应NTP取代dNTP的能力，参与的这个NTP可以作为1个特殊切割位点而被降解，得到带有NTP末端的DNA片段，这是化学法测序的主要原理。③

加减法主要原理是在限制使用dNTP条件下加入DNApolⅠ和T4诱导的DNApol同时反应。在减法反应中从4个反应混合物中每4个dNTP中减去1个。生长链沿着引物延伸至缺少的那个dNTP为止。在加法反应中所用的dNTP只有1种，如dATP，通过DNApol3′→5′外切酶活性使链终止在带有A的3’末端用其它3种dNTP进行类似反应，这样通过加或减法8个混合物的电泳结果即可推出DNA链的顺序。

35（3）DNA序列分析35（二）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段－Klenow片段酶

基因工程很多情况下，E.coliDNApolⅠ可用它的1个大片段Klenow片段酶代替。该酶是枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解E.coliDNApolⅠ所得到的。

1.Klenow大片段是一条多肽链，MW76KD，保留了E.colipolⅠ的5′→3′DNA聚合酶，3′→5′外切酶活性。

2.Klenow在基因工程用于：(1)补平用限制酶消化dsDNA得到的5’粘性末端（即3’延伸末端）5’－G-OHKlenow,Mg2＋5’－GAATT3’－CTTAADntp3’－CTTAA(2)同（1），填平过程中，用32pdNTP标记DNA片段3’末端。(3)cDNA克隆了中，用于合成cDNA的第二条链。(4)在Sanger双脱氧法ddNTP系统进行序列分析。

36（二）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段－Klenow片段酶36（三）T7噬菌体DNA聚合酶及测序酶:1.

T7噬菌体DNA聚合酶

（1）来源

T7噬菌体感染的E.coli诱生的DNApol是两种蛋白的复合物（T7噬菌体基因蛋白和宿主硫氧还原蛋白的紧密复合体）。（2）

酶的活性

与Klenow片段（酶）相似，有5’－3’聚合活性以及3’－5’外切酶活性，无5’－3’外切酶活性。①

5’－3’聚合活性其5’－3’聚合能力和合成DNA平均长度较目前已知的其它任何DNApol都强（持续聚合能力强）。可用于拷贝长段模板的引物延伸反应。②

3’－5’外切酶活性较Klenow酶强1000倍，其用途与Klenow酶一致，不同的是在于可对3’突出端的DNA分子进行末端标记。

2．测序酶

是经过基因工程改造的T7噬菌体DNApol，它完全丧失了外切酶的活性，故该酶是Sanger双脱氧法对长片段DNA进行序列分析的理想用酶（商品名即测序酶）。

37（三）T7噬菌体DNA聚合酶及测序酶:37

（四）TaqDNA聚合酶(TaqDNApol，Taqpol）

该酶是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，具有5’－3’聚合活性以及依赖5’－3’聚合酶作用的外切酶活性，聚合酶的最适反应温度是75℃－80℃,37℃活性有10％。该酶的主要用途是进行PCR反应（详参聚合酶链，polymerasechainreaction）1.来源1969年在美国黄石公园温泉分离出一种嗜热真菌，即水生栖热菌株（thermusaquaticusstrain,TYC），该菌能在70℃－75℃生长，已经克隆化该菌的基因，cetus公司首次分离纯化了该酶，商品名为TaqDNApolymerase，分子量94KD，－20℃至少可贮存6个月，由于TaqDNApolymerase能抵抗链分离所需要的高温（94℃－95℃）的反复处理，故只需在第一次热变性后，加一次酶，即可以进行30－40次循环，简化加快了操作程序，实现了PCR的自动化，耐热酶还有VENT、sac等，以Taq应用最广。

38（四）TaqDNA聚合酶(TaqDNApol，Taq

2.使用Taqpol主要考虑下述5个参数（PCR）

（1）热稳定性PCRcycle中，DNA变性处理通常30－60秒，按30个循环累计热变性时间为15－30分钟，Taqpol连续保温30分钟后，仍保持相对高的活力。（2）特异性退火（复性）和延伸的温控对引物模板的转移性影响很大。Taqpol最是反应温度是75℃左右，而退火温度可在55－70℃，因而Taqpol可显著提高引物退火特异性，避免了引物与模板非特异性产物的合成。（3）延伸长度PCR有时需要扩增>1kb的片段，这就要求选用DNApol具有较强的延伸能力。当扩增片段>250bp时，使用Klenow片段时的扩增率大为降低，而Taqpol能从基因组扩增2kb片段。39

39（4）合成产率高

据酶反应动力规律，聚合反应后期会产生平台效应，平台期出现时，合成产物积累多少，直接与DNApol的性能有关。用Taqpol平台期在25轮循环时出现，产物累计达1×107拷贝，高于Klenow片段。（5）忠实性

评价一个DNApol的忠实性在于检测复制过程中核苷酸错误掺入的频率，酶的忠实性是一个关键特性，尤其是PCR扩增物进行DNA序列分析时就显得尤为重要。Klenow片段错误频率约为1/10000,Taqpol约为1/5000，实际应用中，Taqpol经过25轮循环中，延伸产物的任何位点将在400碱基中出现一个分子篡改原始序列。目前已发现T4DNApol的忠实性较上二者好，其碱基错误掺入频率<107。现国外已建立Taq酶克隆菌株，能改进上述性能，增加产量，提高产率。

40（4）合成产率高据酶反应动力规律，聚合反应后期会产生平台（五）

T4噬菌体DNA聚合酶（T4DNApol）1.来源

源于T4噬菌体感染的E.coli。2.酶的活性，相似于Klenow片段，但远远强于Klenow片段（1）5ˊ→3ˊ聚合活性（2）3ˊ→5ˊ外切酶活性（T4pol/Klenow）

3.基因工程中用途与Klenow片段一致（参前，标记末端，填平5’末端），不同的是可对3’突出端的DNA分子进行标记。这是用其强劲的3ˊ→5ˊ外切酶活性切除3’突出端，产生3’凹端。

5’－CTGCCTGCA—3’T4DNApol5’－CTG5’-CTACC

3’-GACGG32P-dCtp,dNtp3’－GACGG3’-GACGG41（五）

T4噬菌体DNA聚合酶（T4DNApol）4五．核酸酶

常用的的单链特异的SI核酸酶（核酸酶SI,nucleaseSI，SI）和BAL31。（一）核酸酶SI(SI核酸酶，nucleaseSI，SI，常用的核酸酶)

1.来源源于米曲霉素（aspergillusoryzas）2.酶作用底物ssDNA、ssRNA、dsDNA、或DNA-RNA杂交链。3.酶活性有低、中、极高3种情况变化－(1)降解ssDNA或ssRNA形成5’p末端的单或寡核苷酸，对DNA活性强于>RNA,如：ssDNA或ssRNASI，PH4,5Zn2＋5ˊpdN或5ˊprN(2)中量SI可从切口（Nick）或小缺口（smallgaps）处降解dsDNA，(3)极大量的SI才能讲解dsDNA或DNA-RNA杂交链，原因是后者对SI讲解有抗性，所以SI又称单链特异的核酸酶。在基因工程中用于：①去除DNA片段的粘性末端而产生平端。②打开cDNA中的发夹环，使其成平端。③分析DNA：RNA杂交体结构，可证明基因内部内含子的存在（当一条DNA与它的mRNA杂交时，如果杂交链中有RNA－loop环，SI可切开这个环，这是基因中有间隔顺序证明。42五．核酸酶42(二)BAL31核酸（源于乳白短杆菌）

1.来源乳白短杆菌。2.酶活性3’外切核酸酶活性和内切核酸酶活性。3.（1）3’外切核酸酶活性：底物平端dsDNA或dsDNA切口；3’－OH突出端或ssDNA；dsRNA。（2）内切核酸酶活性：DNA的单链区；底物DNA螺旋构象有所改变的双链区。4．基因工程用于：（1）通过可控方式去除dsDNA末端的核苷酸→用于基因克隆表达、缺失突变等。（2）与限制酶协作→建立物理图谱。（3）确定DNA的二级结构→如z－DNA与b-DNA的结合部位等。

43(二)BAL31核酸（源于乳白短杆菌）43六、末端转移酶（TTE）（一）来源小牛胸腺。是仅存于前淋巴细胞及淋巴样细胞内的一种不同寻常的DNApol，催化dNTP加到DNA分子3’－OH末端，也称末端脱氧核苷酰（酸）转移酶（terminaltransferase，TTE）。（二）底物带3’－OH末端的ssDNA具有延伸3’-OH末端dsDNA或平端dsDNA的作用。（三）酶活性：1.催化一个单核酸（dNTP）－>加到另一个DNA分子的3’－OH末端，如：ssDNA－OHTTE，Mg2＋或Mn2＋DNA－pd（N）n＋ppindNTP2.平端或带延伸3’－OH末端的dsDNA需要Co2＋存在才能作模板，如：dsDNATTECo2＋DNA－pd（N）n＋nppindNTP（四）

基因工程中用于：

1．加一个互补同源多聚尾－>到载体和cDNA－>造成便于重组的人工粘性末端。2.在32p存在时，用于标记DNA分子的3’末端。44六、末端转移酶（TTE）44七、碱性磷酸酶（alkalinephoptase,APE）

APE包括BAP（细菌碱性磷酶和CIP（小肠碱性磷酶）。功用如下：（一）去除DNA、RNA和dNTP的5ˊ磷酸根。（二）去除5ˊ-P，防止DNA片段或载体自身环化。（三）32p标记5ˊ—末端前，先用其去除DNA或RNA上的5ˊ-P。45七、碱性磷酸酶（alkalinephoptase,APE几种重要的工具酶的酶学性质及在基因工程中的应用酶来源活性底物辅因子特点用途1.限制酶（Ⅱ）(restrictionendonuclease,restrctionenzymes）微生物400RE/350M内切dsDNAMg2＋特异性识别和切割dsDNA,产生平头或粘性（5’-3’-）末端1．DNA重组2.组建新质粒3.构建物理图谱4.制备探针5.DNA序列分析6.分子杂交2.连接酶（ligase）T4phage连接两个片段dsDNAMg2+ATP活力：粘端>平端1．DNA重组2.DNA序列分析3.DNA聚合酶Ⅰ（DNApolⅠ）E.coli5’－3’聚合；3’-5’外切；5’-3’外切ssDNAdsDNAdsDNAssDNAMg2＋对dsDNA外切活性可被5’－3’pol活性所1.制备探针2.DNA序列分析46几种重要的工具酶的酶学性质及在基因工程中的应用酶来源活性底酶来源活性底物辅因子特点用途4.逆转录酶（ReverseTranscription）RNA肿瘤病毒RNA→cDNA；DNA→DNARNAseH解旋ssRNAssDNARNA:DNAcccDNAMg2＋RNA指导DNA指导解超螺旋制备cDNA5.SI核酸酶（NaseSI）米曲霉切单链ssDNAssRNAZn2＋切除单链切尾巴，产生平端，用于质粒组建和DNA重组6.Bal31乳白短杆菌外切dsDNACa2＋5’3’两端同时筹速外切7.末端转移酶（TTE）小牛胸腺加dNTP到DNA分子3’－OH末端dsDNAorssDNA3’-OHMg2＋Co2＋存在可具有延伸3’－OH的DNA为模板造成人工粘端，便于重组；32p标记DNA分子3’末端8.BIP/CIP细菌/牛肠切除磷酸ds,ssCa2＋Mg2＋阻断片段或载体自身环化。47酶来源活性底物辅因子特点用途4.逆转录酶（ReverseR第三节载体一．载体的概念：

1.要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。

2.凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以插入或克隆DNA片段统称为vector。3.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA48第三节载体48二、载体的分类分类依据类别克隆扩增或表达举例1.按功能分成（1）克隆载体（2）表达载体√√PBR322PCDN32.按进入受体细胞类型分（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体PUC8PBUDCE41YE3.按载体来源分病毒载体＋4.按克隆片段得大小（克隆能力）分(1)<1kb(2)<10kb(3)<22kb(4)<50kb(5)0.1-0.4Mb(6)0.5-2Mb(1)M13(2)plasmid(3)λphage(4)casmid(5)BAC(6)YAC√49二、载体的分类分类依据类说明：1.穿梭载体（sbuttlevector）

指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间，如：YEP,DIDB2192.YAC

YeastArtificialChromsome由酵母基因和PBR322质粒衍生物构成，对克隆大的真核基因十分有用，在HGP中发挥主要作用。3.BAC

细菌人工染色体。50说明：50三、基因工程载体的3个特点：（一）都能独立自主的复制

载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被动的跟着载体一起复制/扩增，就像载体的正常成分一样。（二）都能便利的加以检测

如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因，将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。（三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。

51三、基因工程载体的3个特点：51四、克隆载体和表达载体：

所有的载体可以分成两大类：克隆载体和表达载体。其中最常用的是质粒载体。（一）概念：1.克隆载体（cloningvector）

都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。2.表达载体（Expressionvector）

具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。为了有效的转录，必需有强大的能够被宿主细胞识别的启动子，为了实现翻译，克隆基因必需有合适的SDs和RbS。这样一个基因表达需要的具有表达和调控能力的载体称表达载体。52四、克隆载体和表达载体：52（二）载体的元件及性质

克隆载体ori→Amp→Mcs

E.coli表达载体元件P→Rbs/SDs→Mcs→terms

真核表达元件P/E→Mcs→terms→加poly（A）信号克隆载体元件以及性质E．coli表达载体哺乳动物质粒细胞表达载体1.

Ori能在受体细胞中复制，含有复制位点（起点）2.

Ampr

抗生素抗性基因可以便利加以检测3.MCS多克隆位点，克隆携带外源基因片段4.

载体可导入宿主细胞（生物学/非生物学方法）1.

Ori2.Ampr3.Mcs4.

Promoter5.

SDsRbs6.Terms7.可导入E.coli1.orip在E.coli中能作复制起始位点2.Ampr细菌抗生素抗性基因3.Kanr真核细胞（哺乳类）药物抗性基因4.Orie真核细胞复制起始位点5.Mcs多克隆位点6.

P/E启动子/增强子7.

Terms终止信号8.

加poly（A）信号9.

可导入真核细胞（哺乳类）（7－8别为转录翻译终止密码，真核细胞表达元件。）53（二）载体的元件及性质

克隆载体ori（三）元件的类别和质量：基因工程前考虑的4个问题：

(1)基因工程的目的克隆扩增/表达:①生产产品②基因治疗(2)克隆片段的大小运载多大重量的车子。(3)受体细胞类型真核/原核/穿梭。(4)载体本身及其元件的质量不能搞成“豆腐渣工程”，如P要“强大阵容”。54（三）元件的类别和质量：541.Ori－复制起始点（origin，ori）（1）决定质粒自我增殖和拷贝数的主要元件。（2）使繁殖后细胞维持一定量的拷贝数。（3）一般情况下，一个质粒只含一个ori，构成一个独立的复制子。（4）穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子，以确保两类细胞中都能扩增。（5）基因工程使用松弛复制子，以获得更多的基因产品。

复制子是一段包括复制起始位点，反式因子作用在内的DNA片段，其功能是通过复制使质粒能稳定存在宿主菌内（如E.coli）。松弛复制子的特点①拷贝数多，10－200个，分子量小。②复制不受宿主细菌复制系统的限制，仅需DDDPI，当宿主蛋白质合成受到抑制（如培养中加入氯霉素时）其拷贝数猛增至1000－3000之多，该性质多基因工程技术十分有利。③分子量小，不具备自传递能力。④基因工程使用松弛型质粒，如含PBMI复制起点的质粒。551.Ori－复制起始点（origin，ori）552.抗生素抗性基因：（genotype）编码产物功能（phenotype）（1）Ampr酶水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。（2）tetr1个膜蛋白可以阻止四环素进入细胞。（3）camr乙酰转乙酶生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活（5）hygr潮霉素β磷酸转移酶使潮霉素β失活。562.抗生素抗性基因：563.

MCS——多克隆位点（multiplecloiningsite，MCS）（1）MCS

是多个限制酶识别的一段DNA顺序，以便克隆/插入外源基因/DNA片段，与之相关概念有：（2）多聚接头（polyliker）有些质粒载体单一切点少，不能普遍使用。为了扩大使用范围，可以加一段有许多限制酶识别的单一切点的多聚接头。（3）人工接头（linker）

是用若干个bp组成的dsDNA片段，一般有一个或以上限制酶识别与切割的顺序。(2)与（3）已经商品化，注意liker与adaptor的区别（下述）573.MCS——多克隆位点（multiplecloin4，启动子（pormoter）（1）概念：

①促进DNA转录的DNA顺序，又称启动基因或启动序列。

②这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游（up－stream），RNApol结合在上面，指导酶朝向正确的转录位置。③启动子又称启动基因，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。④DNA分子一个与启动子基因转录有关的区域，包括RNApol识别，结合和转录起始3个功能部位。584，启动子（pormoter）58（2）原核生物启动子和真核生物启动子的比较启动子功能性质：①决定转录方向，启动启动下游（down－stream）基因互补链转录，转录mRNA与信息链一致。②决定dsDNA的哪一条链作为模板，转录出RNA。③决定转录效率，强启动子转录效率强，弱次之。④启动子是可以接受调控的，可以被改造的。原核生物E.coli启动子长约40－60bp真核生物启动子识别位点－35bp（α2ββσ）TATA因子（TFⅡD）先结合TATAbox，再结合RNApol结合位点－10bp（即TATA合）－25bp，富含AT称为TATA合或Hogness合，与RNApolⅡ结合。起始位点＋1－＋20bp＋1bp，转录合成RNA第一个bp的位置（同左）59（2）原核生物启动子和真核生物启动子的比较启动子功能性质：原（3）基因工程中常使用强启动子

表达系统常用启动子及备注1.Ecoli（1）Lacuv5（乳糖uv5启动子）（2）trp（色氨酸启动子）（3）Tac（乳糖色氨酸杂合启动子）（4）λPL（λphage左向启动子，包括CI857ts阻遏子）2.酵母（1）己醇脱氨酶启动子（2）酸性磷酸酶启动子3.哺乳动物细胞（1）SV40启动子（带有增强子）(2)腺病毒晚期启动子（3）Melallothionen基因启动子4.昆虫细胞（1）多角蛋白基因启动子（2）10K蛋白基因启动子5.植物（1）花叶菜花叶病毒启动子（2）Napalin合成酶启动子（3）微蛋白启动子。（Tubulin）60（3）基因工程中常使用强启动子表达系统常用启动子及备注1.用于原核表达系统的强启动子①Lac→②Lacuv5→③Trp→④Tac→⑤λPL→⑥T7

名称来源组成正调控负调控备注1．LacE.coli乳糖操纵子（1）Pg（启动基因）；（2）CAP（降解物激活蛋白基因）；（3）O（操纵子）；（4）S（部分β－半乳糖苷酶结构基因）。分解代谢系统：CAP－cAMP－>激活P（启动子）－>促进转录阻遏物－R调节基因R编码产物产生阻遏蛋白－>结合在O上（操纵基因）－>阻止转录存在乳糖时－>乳糖－>结合阻遏蛋白－>解除对转录阻遏－>开始转录2．Lac－uv5是一个突变乳糖操纵子IPIG是β－半乳糖苷酶底物类似物－>它能与阻遏蛋白结合－>使O成游离状态对分解代谢抑制不敏感－>即使没有CAP－cAMP－>转录照常进行据报首Lac组建载体在原核细胞表达时IPTG可提高真核基因表达水平50倍。61用于原核表达系统的强启动子①Lac→②Lacuv5→③Trp名称来源组成正调控负调控备注3．Trp从E.coli色氨酸操纵子分离（1）Pg（启动基因）；（2）R（制动基因）；（3）O（操纵基因）；（4）SE（色氨酸Trp部分结构基因）。β－吲哚丙烯酸是Trp的竞争性抑制剂－>它能与阻遏蛋白结合－>阻止了Trp与之结合而活化－>使转录进行调节基因产生阻遏蛋白，结合Trp有活性－>再结合在O上阻止转录－>缺乏Trp－>阻遏蛋白不能活化－>去阻遏据报道β－吲哚丙烯酸在转录水平至少可以增强50倍↑，另外制动基因缺乏可提高转录水平↑8－10倍4．Tac（Trp－Lac）人工构建的Trp＋Lac杂合启动子（1）tacⅠ=Trp-35+Lac－uv5-20；（2）tacⅡ＝Trp-35＋一个合成的46bp片段；包括pribrow合和LacO（3）tac12＝Trp－35＋Lac－10区，操纵基因O部分，SD顺序融合而成。IPIG诱导受Lac阻遏物的调控（1）比Lacuv5强7倍；（2）受体菌有RB791，XL－blue，SB221，JM109等。5。T7噬菌体启动子带有Lacuv5启动子控制的T7噬菌体RNApol基因IPIG诱导（1）比Lacuv5强7倍；（2）受体菌有RB791，XL－blue，SB221，JM109等。62名称来源组成正调控负调控备注3．Trp从E.coli色氨酸操5.增强子/沉默子（enhancer，E/silencer（negatireenhancer）

（1）概念为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。（2）增强子的作用特点①可在基因的5’或3’端发挥作用，一般在5’端转录起始点上游－100至－300bp处。②

不受序列方向制约；③

通过增强启动子发挥作用。（3）增强子的作用机制：①

改变DNA的螺旋结构，使其成柔曲线－>拉近E/P距离；②

为DNA模板提供某一特定空间微环境－>促进top异构酶改变DNA双螺旋结构；③

为RNApol和反式作用因子提供一个与顺式元件联系的结构。如增强子的荃环利于与反式因子结合。635.增强子/沉默子（enhancer，E/silencer（6.

核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）

mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列（位于AUG上游3－11bp处由3－9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16sRNA富含嘧啶的序列互补，是RNA识别和结合的位点。由于J.shine－LDagarne（1974）首先发现，故名。

mRNA5’AGGAGG－UUGACCU－AUG3’AUCCUCC－UAG,rRNA的3’末端（1）翻译水平的调控是不严格的，只有mRNA/Rbs结合才是蛋白质合成的关键。（Rbs是E.coli表达载体必不可少的元件）。（2）不同的启动子表达一种pr.时，SD－AUG之间的距离可能是不一样的，在试图提高表达效率，SD－AUG之间的距离是重视的因素之一。646.

核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/7．转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子（terminatorotranscrition，termterminatoroftranslation,terminator

codon,stopcodon）：

（1）转录终止子/term

指一个基因编码区downstream的DNA顺序，可被RNApol识别为停止合成mRNA的信号。原核生物中，在转录部分末端term常有一个IR和紧接着的一小段，基因转录部分之外可能还有影响转录终止的顺序。值得注意的是：①有些载体不含终止序列，表达外源蛋白质时也可获得较满意的结果（基因转录之外顺序可影响转录终止）；②多数外源蛋白质表达载体带有合适的终止顺序；③转录终止顺序有长有短，短的长约700－800bp。（2）翻译终止密码子/terminatorcodon

mRNA种三个核苷酸顺序可终止蛋白质的合成，有3种终止码：UAA（赫石型）UAG（琥珀型）和UAG（空白型）（参nonsensemutationsupperessor。）657．转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子（terminat8．加poly（A）尾信号

结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。mRNA转录到此后，产生AAUAAA和随后的GU或U丰富区，与RNApol结合的延长因子，可以识别这种结构并与之结合，然后在AAUAAA下游10－30bp的部位切断RNA，并加上poly（A）尾。

关于7和8，至今，对真核转录终止信号/终止机制了解不多,主要困难是难以确定原初转录物的3’末端，因为大多数基因转录后很快进行加工。现在基因工程表达载体使用的转录终止子都是病毒基因或细胞基因3’端的一段序列，其中包括3’不翻译区，终止位点和poly(A)位点（整段照搬）。668．加poly（A）尾信号66第四节重组DNA技术的基本过程

基因工程包括3个步骤：1．

DNA重组2．

重组DNA导入宿主细胞－克隆扩增或表达3．

基因工程的后处理（down－streamtechniquesofGE）重组DNA技术的基本过程：1．

载体的选择和制备——分；2．

制备目的基因片段——切；3．

DNA片段的重组连接——接；4．

重组DNA导入受体细胞——转；5．

转化子的筛选——筛；6．

重组子的筛选——筛；7．

重组子的鉴定——鉴；8．

克隆扩增或表达——扩/表达；9．

基因工程的后处理——分。67第四节重组DNA技术的基本过程基因工程包括3个步(xbalI)EcoRIEcoRI(HindIII)PUC(xbalI)EcoRI(HindIII)EcoRIEcoRI+EcoRIEcoRIEcoRIEcoRIDigestionwithEcoRIRecoveryofAPPAIDNAframagaros