原子力显微镜

食品化学综述原子力显微技术及其在多糖中的应用原子力显微镜一、概述

光学显微镜分辨率一般仅能达到µm级水平。电子显微镜，以投射或反射的方式成像，最高分辨率可达5nm。但同样只能获得样品表面的二维信息。1986年，Binning，Quate和

Cerber发明了第一台原子力显微镜(atomicforcemicroscope，AFM)。AFM可以用于观察物质表面总电子密度的形貌，弥补了扫描隧道显微镜(STM)不能观测非导电样品的缺陷。同时，AFM超越了光和电子波长对显微镜分辨率的限制，可在三维立体上观察物质的形貌和尺寸，并能获得探针与样品相互作用的信息。

原子力显微镜与前面的两种显微镜相比有明显不同，它用一个微小的样品探针来“摸索〞微观世界。在立体三维上观察物质的形貌。并能获得探针与样品相互作用的信息。典型AFM的侧向分辨率〔x，y方向〕可达到2nm，垂直分辨率〔z方向〕小于。特点：操作容易、样品准备简单、操作环境不受限制、分辨率高等优点。二、基本原理它是用微小的探针“摸索〞样品表面来获得信息。当针尖接近样品时，针尖受到力的作用使悬臂发生偏转或振幅改变。悬臂的这种变化经检测系统检测后转变成电信号传递给反馈系统和成像系统，记录扫描过程中的一系列探针变化就可以获得表面的信息图像。仪器包括检测系统，扫描系统和反馈系统。(如图1〕1、检测系统悬臂的偏转或振幅改变可以通过多种方式检测，包括：光衍射法、光干涉法、隧道电流法、电容检测法等。目前AFM系统中常用的是激光反射检测系统，简单灵敏。此系统由探针、激光发生器和光检测器组成。1〕探针〔AFM检测器的关键部分〕。由悬臂和悬臂末端的针尖组成2〕光检测器2、扫描系统3、反馈控制系统

其功能主要有：1〕提供控制压电转换器x－y方向扫描的驱动电压；2〕在恒力模式下维持来自显微镜检测环路输入模拟信号在一恒定数值。恒力模式反馈模式恒高度模式三、AFM的基本成像模式包括以下4种：接触式〔contactmode〕非接触式(non-contactmode〕敲击式〔tappingmode〕升降式〔liftmode〕1)接触式成像模式在此模式中，针尖与样品表面进行“软接触〞。当探针逐渐靠近样品时，探针表面原子与样品表面原子先相互吸引，一直到原子间电子云相互静电排斥。这种静电排斥随探针与样品表面原子的进一步靠近，逐渐抵消原子间的吸引力。当原子间距离小于1nm，约为化学键长时，范德华力为0。

在力学曲线中有5个区域,从ⅰ开始,这是探针和样品相距较远,它们之间没有什么作用力,悬臂也不会发生偏转;ⅱ当探针与样品进一步靠近,它们之间出现相互引力和斥力,从而导致悬臂发生偏转,这时斥力相互作用越来越明显;ⅲ当探针和样品接触时,悬臂偏转更加明显,作用力呈线性增加;ⅳ当达到最大偏转时,探针不再前进,开始回缩,此时受到黏滞力为主的各种力的作用,延缓了样品和探针的分离,ⅴ最后探针移动到其与样品的距离足以使悬臂的偏转重新为0的位置.当合力为正值时〔排斥〕，原子相互接触。由于在接触区域范德华力曲线斜率很高，范德华斥力几乎抵消了使探针进一步靠近样品表面原子的推力。当探针弹性系数很小时，悬臂发生弯曲，通过检测这种弯曲就可以进行样品形貌观察。假如设计很大弹性系数的硬探针给样品表面施加很大的作用力，探针就会使样品表面产生形变或破坏样品表面，这时就可以得到样品力学信息对样品表面进行修饰。除范德华力外，在接触式AFM中还经常遇到两种力：毛细作用力和探针悬臂弹簧弹力。2〕非接触成像模式探针以特定的频率在样品表面附近振动。探针和样品表面距离在几纳米到数十纳米之间，这一距离范围在范德华力曲线上位于非接触区域。此时探针和样品表面所受到的总力很小。通常在10-12N左右。在非接触式AFM中，探针以接近于其自身共振频率的频率(一般为100KHz~400KHz)及几纳米到数十纳米的振幅振动。当探针接近样品表面时，探针共振频率或振幅发生变化。检测器检测到这种变化后，把信号传递给反馈系统，然后反馈回路通过移动扫描器来保持探针共振频率或振幅恒定，进而使探针与样品表面平均距离恒定。计算机通过记录扫描器的移动获得样品表面形貌图。3)非接触式成像模式与非接触式AFM比较相似，当它比非接触式AFM有更近的样品与针尖距离。和非接触式AFM一样，它是以一种恒定的驱动力使探针悬臂以一定的频率振动〔一般为几百千赫〕，振动的振幅可以通过检测系统检测。当针尖刚接触到样品时，悬臂振幅会减小到某一数值。在扫面样品的过程中，反馈回路维持悬臂振幅在这一数值。当针尖扫描到样品突出区域时，悬臂共振受到阻碍变大，振幅减小；反之，当针尖扫描到样品凹陷区域时，悬臂共振受到阻碍变小，振幅增大。悬臂振幅的变化经检测器检测并输入控制器后，反馈回路调节针尖和样品的距离，使悬臂振幅保持恒定，反馈调节是靠改变z方向压电陶瓷管电压完成的。当针尖扫描样品时，通过记录压电陶瓷管的移动就得到样品表面形貌图。与以上两种模式比的优点是有效防止了样品对针尖的黏滞现象和针尖对样品的损坏。当遇到固定不牢的样品时，用接触式AFM成像使样品因摩擦力和黏滞力被拉起，从而产生假象。而非接触式成像那么分辨率低。不能得到样品的精细结构形貌，敲击式集中了接触式分辨高和非接触式样品损坏小的优点。得到了既反映真实形貌又不破坏样品的图像。另一优点是它的线性操作范围宽，这为反馈系统提供了足够高的稳定性，从而得到了样品检测的重现性。4〕升降成像模式AFM家族中的一些技术需要除去形貌特征而得到特征信息。在磁力显微镜和静电力显微镜中，首先获得高度信息，然后把针尖抬到设定的高度〔一般为10～100nm〕，再沿形貌图线扫描样品，从而得到除去高度影响的静电力和磁力分布。该方式针尖和样品的距离不受形貌的影响，所得到的图像反映针尖与样品产生作用力的变化，如磁力线分布等。四、AFM的分辨率分辨率包括：侧向分辨率：决定于采集图像的步宽

〔stepsite〕和针尖形状。垂直分辨率1、步宽因素图像采集点如下图，扫描器沿着齿形路线进行扫描，计算机以一致的步宽取数据点。每幅图像取512×512数据点计算，扫描1µm×1µm尺寸图像得到步宽为2nm〔1µm/512〕，高质量针尖可以提供1～2nm的分辨率。由此图可知，在扫描样品尺寸超过1µm×1µm时，AFM的侧向分辨率是由采集图像的步宽决定的。二、针尖因素AFM成像实际上是针尖形状于表面形貌作用的结果，针尖的形状是影响侧向分辨率的关键因素。针尖影响AFM成像主要为：针尖的曲率半径和针尖侧面角〔tipsidewallangles〕。曲率半径决定的是最高侧向分辨率，而探针的侧面角决定最高表面比率特征〔highaspectratiofeature〕的探针能力。曲率半径越小，越能分辨精细结构

当针尖有污染的时候会导致针尖变钝，使得图像灵敏度下降或失真。但钝的针尖或污染的针尖不影响样品的垂直分辨率。样品的陡峭面分辨程度决定于针尖侧面角的大小，侧面角越小，分辨陡峭的样品表面能力就越强。AFM的垂直分辨率与针尖无关，而是由AFM本身决定的。它还与下面的几个因素有关：1〕扫描器分辨率。好的仪器可提供的垂直分辨率。2〕噪音的影响。可提供的噪音影响。3〕AFM象素影响。可满足最小可分辨率尺寸。六、AFM的工作环境1〕真空。STM〔扫描隧道显微镜〕需要用超高真空，使用真空可避免大气和水膜的干扰，但操作复杂。2)气相环境。可在空气中操作。但多受样品表面水膜的干扰。3〕液相环境。适合于生物体、腐蚀或任一液固面4〕电化学环境。五、AFM表面分析工具——力学曲线七、AFM假象光镜和电子显微镜成像都受电磁衍射的影响，这给它们辨别三维结构带来困难。而AFM可弥补这些不足。出项假象的情况：1〕针尖成像。当针尖比样品特性更尖时那么会出现假象。2〕钝的或污染的针尖。3〕双针尖或多针尖假象。4〕样品上污染物引起的假象。八、AFM在多糖中的应用1、高分子领域〔包括纳米结构，微观尺寸下材料的性质，多分子样品的相分布，亚表面结构〕1〕形貌观察AFM可以在高分子表面形态，纳米结构，链堆砌〔chainpacking〕和构象等。可以通过接触式、敲击式AFM来研究高分子的形貌。接触式研究形貌的分辨与针尖和样品接触面积有关，一般来说，二者的接触尺寸为几纳米，接触力越小，接触面就越小。同时也减小针尖对样品的破坏。为了获得高分辨率高分子图像，人们用各种方法对样品进行微力检测。液相中扫描可减少水膜影响〔作用扫描力几纳米〕。高度图除了研究表面形貌外，还可以用侧向力图像获得样品精细结构，对于平整的样品表面来讲，侧向力图像可以反馈样品不同区域的摩擦力。而对起伏的表面，侧向力图像有助于形貌特征的研究。2〕AFM对高分子材料纳米机械性能的研究。3〕高分子组分分布的研究。4〕近表面结构的研究。

2、多糖分子结构的AFM研究

AFMimagesofcordycepspolysaccharidesdepositedontomica.

蔡林涛等将纯化后的虫草多糖制成mg／InlJ的水溶液，滴在Ni2＋离子处理过的新剥离的云母上，干燥后进行AFM扫描观察。虫草多糖分子链呈分枝结构，而且互相缠绕，链之间通过糖单元不同的连接方式衍生出许多大大小小的环，尺寸在50-240nm范围，单链的厚度为nm，长度为几个μm，宽度为20-40nm。宽度远大于单链分子的估算值，同样的现象也出现在DNA的AFM观察中。其原因是AFM探针的曲率半径在5-20nm范围内，不够小，导致扫描时存在增宽效应。

果胶(pectin)多糖来源于植物细胞壁，对植物也有一系列的活化功能，是存在的最复杂的天然聚合物，在食品和制药工业上十分重要AFMimagesofpectinpolysaccharidesdepositedontomica.

细茵多糖黄原胶

AFMimagesofxanthanpolysaccharidesdepositedontomica.

Gellan凝胶多糖AFMimagesofgellanpolysaccharidesdepositedontomica.

Gellan凝胶多糖形成凝胶后网络结构AFMimagesofgellangelnetworkdepositedontomica

角叉聚糖和gellan胶的网络结构AFMimagesofgellanandxyloglucannetworksdepositedontomica.

2、淀粉粒的AFM研究

淀粉是多糖家族中重要的一员，主要来源于谷类和薯类植物，是由葡萄糖残基通过糖苷键连接起来的多羟基化合物，有直链和支链(枝权状)两种分子，分别称为直链淀粉和支链淀粉。

淀粉的初生态是颗粒状，大小与外形因来源不同而有所区别。马铃薯淀粉颗粒为球形，外径在15-100μm范围内，玉米淀粉颗粒为多边形，外径在5-25μm之间，而稻米的更小为3-8μm。对淀粉结构的认识分为淀粉颗粒的表面形态结构和内部结构，淀粉的分子链结构。

直链淀粉的AFM图像AFMimagesofamylosethathavebeendepositedontomica(a)

Overlappingamylosemolecules,(b)Branchedamylosemoleculeshowingasinglelongbranch,(c)Branchedamylosemoleculedisplayingshortbranches

马铃薯淀粉粒的AFM图像AFMimagesofstarchgranule(a)driedstarchgra