病毒感染细胞试验整体流程和原理

专业资料整理分享病毒感染细胞实验整体程及原目的基因能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成净孽来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。1、净孽的种类病孽有很多种，常见的有慢病孽和腺病孽慢病孽原慢病毒（Lentivirus）是逆转录净孽的一种。构建的siRNA/miRNA慢净孽载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA克经过慢冲孽包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进长时间的稳定表达。特点1）直接包装成为假病孽颗，对分和非分细胞均有感染作用，适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞（比如经元细胞、干细胞或其它原代细胞）。2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。完美WORD格式编辑专业资料整理分享3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。4）无需任何转染试剂，操作简。5）可以根据客户需要制备多种标记。慢病毒包装简要程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质纯化提取。2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。3）培养48hrs-72hrs左右，收集含有病毒的上清培养液。4）病毒的纯化和浓缩。5）分装、-80℃保存。6）滴测定目的基因检定，并出具检测报告。、腺病毒原腺病毒（Adenovirus，Ad）是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制依赖于宿主细胞的分。有近50个血清型，大多数Ad载体是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，低病毒的复制能。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。完美WORD格式编辑专业资料整理分享特点1）几乎可以感染所有类型的细胞2）可以获得复制缺陷型（E1和E3缺失）的腺病毒3）病毒滴高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012PFU/mL，能有效的进增殖。4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容，操作简单.5）感染细胞时，整合到染色体中，存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。腺病毒包装简要程构建表达siRNA/miRNA的腺病毒载体2）采用PacI消'化纯化的质。3）消化好的腺病毒表达载体转染293A细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。4）将病毒粗提液感染293A细胞以扩增病毒。5）分装，-80℃保存。慢病毒和腺病毒的比较完美WORD格式编辑

专业资料整理分享慢病毒载体系统和腺演毒载体系统比较网毒表达系统慢病毒去达系筑VLentivirus）腺病毒表达系统tAdenoYirus）病毒基因组RNA病得双链DNA病寿复制白主复制自主复制是否整合病毒基因蛆整合于宿主基因组.长时同,稳定表达外游基因病旅某因组游离于宿主基因殂外，瞬时表达外源显因感染细胞类型感染打裂和不分裂细胞，适用于难转染的嘲（细胞（如冲经细胞1及体内实验感染分裂和不分裂细胞表达风度中水平表达高水平表达 ：表达时间慢（1-3天）快（1-2天）滴度漪度最高叮达lirSpfLJ/ml滴度最高।•「达1口*11pfU/nt]克隆容量可插入不超过8kb的外源片段r清度睡插入片段长度增加而降低可插入高达8匹的外源Ji,段，滴度随插入片段长度增加而降低免疫原性低免疫原性高免疫原性2、构建目的基因到载体构建手段一般是根据原始质信息确定克方案，有以下两种手段。1）如果原始质与载体有匹配酶位点，采用相应的内酶下相应片段，回收并连接到坪体，酶，并测序鉴定完美WORD格式编辑

专业资料整理分享PCR扩增，得到一并2PCR扩增，得到一并目的片段，采用相应的内酶下相应片段，回收并连接到穿梭载体，酶，测序鉴定质载体概能够进自主复制的环状 DNA双链结构，包括其核生物的细胞器（主要布线体和叶绿体）中和细菌细胞拟林区以外的环状脱氧核核酸（DNA）分子特征质上常有抗生素的抗性基因，如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质称为附加体（episome），这类质能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上浮下来成为游离于染色体外的DNA分子。质在宿主细胞体内外可复制。通过个些特性，人们可以把一些目的DNA片断构建在质中， 通过转化入大肠杆菌中，用选择培养基来筛选从不断的复制，来得到目的产物。3、质DNA在大肠杆菌转化连接上目的基因的质转化大肠杆菌是为让目的基因在大肠杆菌扩增， 然后提取质，以下是质DNA在大肠杆菌转化的三步骤。大肠杆菌感受态细胞的制备完美WORD格式编辑专业资料整理分享1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌于 3mlLB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。2）取0.4ml菌液转接到40mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2〜3h3）菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min4）4℃离心10min（4000r/min）5）倒出培养液，将管口倒置以培养液尽6）用冰浴的0.1mol/L氯化第10ml悬浮细胞沉淀，即冰浴 30min7）4℃离心10min（4000r/min）8）倒出上清液，用冰浴的0.1mol/L氯化第2ml悬浮细胞（冰上放置）9）分装细胞，200ul一份，4℃保存质DNA的转化取200ul新鲜制备的感受态细胞，加入质DNA2ul混匀，冰浴30min2）离心管放到42℃保温90s3）冰浴2min4）每管加800ulLB液体培养基，37℃培养1h（150r/min）5）取适当体积（100ul）的复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正直30min完美word格式编辑专业资料整理分享6）倒置平皿37℃，12〜16h，出现菌质提取步骤1）取1〜4ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000转离心1min，弃上清2）加250ul溶液1/RNaseA（溶液1为细胞悬浮液）混合液，漩涡剧振荡直至菌体完全重新悬浮，室温静置1-2min。3）加入250ul：Q^n（细胞解液），轻柔的反复颠倒混匀 5-6次。室温放置1-2min，使菌体充分解，直至形成澄清的解溶液。4）加入350讥溶液山（中和液），刻轻柔地反复颠倒混匀 5-6次，此时会出现白色絮状沉淀。5）12000室温离心10min，收集上清。6）将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2min。7）12000转离心1min，弃滤液。8）加入500ul溶液PB（洗涤液）12000转离心1min，弃滤液，目的是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质质DNA。9）加入500ul溶液W（金盐液），12000转离心1min，弃滤液，重复一次。10）12000转离心3min，以彻底去除纯化柱中残的液体。完美word格式编辑苗域隼璘ayoM美等。*戏3乡猫1期区目修，期包噪区票全产a£=幺蚌田理陀蛋库匚恁，方好石长以包，电、【」久瀚上中产幺即区后洋：电幺久％」加。事攻苓考小品餐酒'©TM日桂母范举E小怅袤用韶匚亳"J港'%'期区XT调丫5JT些工▼0MS范举'石书”&区£6%户飞现区工£6%11力戏麒小2I'f（荽学童妙比）童妙石《现区1€63怅袤才幺荽学用*4VNQi、廿岑强50%->酒。-匚艮口曲号幺£部，艮兑华干皴一一5叫口裁袤000415叫理港，乐t•津酒”。卬讥口08〜09入一产艮口裁I吗」中骁y皴艮^牌部——utuii口裁袤00031艮口裁1%名埒艮^部——鳖一算星，裂挈拉，utuii口裁袤OOOZIZMJOJjnginOOg”——裂挈史5叫口堂袤000411从」。月叫1n003”——毅挈拉，UTUII口裁袤（WO"（1%）i兑华5<%匝皴袤裂也厂峭——UTUIQI"，裁000ZI袤够l「4墓%」。月明1n0% ”——蝇心哩裆，§完号弟之二9寸袤够lT5卡**暇ZSJ°Jjn@inO%”——§品恚曾嗖区恚鲁154°月明1n0%”——3o03-匚埒耕审庄，冬强4y裂嗖，,,幡，8裁位r拉8裁I星彩大春幡生，也U!UI【口裁袤ooozi产艮口堂I吗.【匚留大春也裂靖生：*希幺。岑强50Z-匚幺，VNC幺5韩亶长七包艮用d，utuii口裁袤000ZI（31。quiz埒*暇港，（）8-0这汽Hd，小骞…嗖签长）wniainooi-og”烝恚鲁，产艮口曲号骁匚埒胃“韩VNQ部（II专业资料整理分享4.2共转染的操作步骤第一天：用无抗生素DMEM+10%FBS单板293FT细胞，2ml/孔。确保第二天细胞密达到80%-90%融合第二天：500ul无血清培养基稀释2ug表达质+1.5ugpsPAX2+1.5ugpMD2.G500ul无血清培养基稀释15ul脂质体20005min后，将DNA溶液和脂质体溶液混合，室温静止20min从6孔板中吸出1ml无血清培养基，然后滴加入1ml质和脂质体混合物。6-10h后，移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMED+10%FB（从此刻开始算时间）。第三天：.转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效应达到 70%"上第四天：.转染后48和72h分别收获含病毒的」清。2.3000rpm离心20min，0.45um滤膜过滤，去除细胞沉淀。3.12000转离心浓缩细胞、分装-80。贮存。完美WORD格式编辑专业资料整理分享4.滴测定目的基因检定，并出具检测报告。4.3病毒包装的原质DNA为能转录出慢病毒遗传物质（RNA），但能翻译出慢病毒的外壳及蛋白成分的载体质，其同时连有目的基因和报告基因，psPAX2为能表达慢病毒外壳的质，其表达产物可通过粘附机制穿过细胞膜， pMD2.G为慢病毒的膜蛋白质，通过 lipofectamine2000进三质共转到靶细胞基因组中，宿主基因组在表达时，随宿主基因转录出的目的基因RNA与psPAX2、pMD2.G基因翻译出的蛋白组装为慢病毒。在上述程序中提及的“第四天收集病毒。在第五天再用该病毒感染靶细胞，病毒进入细胞后，其遗传物质RNA反转录出DNA，该基因再整合到春细胞的基因组中，完成转染过程，因为质DNA只能转录出病毒RNA和表达目的基因却能表达出病毒的外壳和膜蛋白成分，因此其能像普通的病毒一样在宿主细胞能反复增殖，故对宿主细胞是无害的并且高效的将目的基因转然到靶细胞基因组中。5、慢病毒感染细胞程图完美WORD格式编辑专业资料整理分享LetiliviralEKpressjonSysEemi感染步骤1）单板：将对数生长期的细胞消化重悬后，按1米105/L密接种于 12孔板，生长过夜2）感染：将70-80%铺满12孔板中的培养液吸除，换新鲜的培养液，同时加入PBS浓梯稀释的病毒液，混合均匀后即可放入孵箱培养。3）24h左右可换液，48小时即可看荧光，具体根据细胞状态来看。荧光显微镜的操作程打开荧光器（30min内能关闭，否则影响显微镜寿命），细胞培养板置于载物台，调节物镜和光圈，先用自然光观察视野内细胞，再关闭光，开启荧光通道，观察荧光强，判定感染。 图片取样前可以调节曝光时间，增值和彩色使荧光照片最完美。（针对leica）注意事项内容完美WORD格式编辑专业资料整理分享.病毒浓要适宜，太少的话细胞被感染的也少，但是病毒浓太大，对细胞有伤害。.感染病毒时培养基少，以保证病毒的浓，在培养10h左右可根据培养基第色加培养基。.在明确细胞感染复数情况下，可进浓梯感染，计算细胞感染复数。.在加病毒后一般24h左右可换液，48小时即可看荧光，具体时间根据细胞状态来看。6、感染后的细胞检测方法荧光初步检测有荧光，则表示病毒感染成功，但并能确定目的基因是否整合到细胞中， 待进一步检测，荧光有强弱之分，与病毒加入的有关。RNA的提取及RT-PCR检测原因为真核细胞DNA含有很多非编码区，真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪和拼接，去掉这些非编码区，才能形成真正的mRNA，，是否表达其核生物的基因并表达相应的蛋白，只能通过提取其mRNA并RT-PCR这条途径来测定RNA提取步骤完美WORD格式编辑专业资料整理分享加ImlTrizol，吹打后移至1.5ml无菌的离心管中；加100ul氯仿剧振荡30s混匀，12000转15min，可看到明显分层；取上层透明液体至新的1.5ml离心管中，外等体积的异丙醇，混匀静置10min，12000转离心10min，弃上清，加1ml70%乙醇，12000转，离心10min，弃上清，及干剩余液体，最后加DEPC-水溶解RNA，电泳，粗步判定RNA纯。RT-PCR步骤：RT是一个逆转录的过程，用前一天提取好的总RNA，在加入引物，模版和酶，并在PCR仪的温设置下，RNA可逆转录为cDNA。PCR是cDNA在模版，引物，酶的作用下进复制成双链DNA。（具体步骤）蛋白提取及Western检测western-Bloting:蛋白免疫印迹（Westernblotting或Immunoblotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子大小在凝胶中分成带。第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种