腺相关病毒包装手册

腺相关病毒（AAV）构建及包装操作手册PAGEPAGE4目录一、 AAV安注意项二、 AAV储和稀注意三、 AAV介绍四、 汉恒生物AAV品服及载体息与货列五、 AAV整实验程六、 实验材料七、 AAV载构八、 AAV包装九、 AAV收和纯十、 AAV滴测定十一、AAV感染细胞测试十二、AAV用于动物实验（重磅干货，五星推荐）十三、案例分享12AV**）AAV（BL-2）内操作。操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。操作病毒时特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%SDS84如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。动物注射操作请在生物安全柜内（BL-2）完成。病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。实验完毕用洗手液清洗双手。二、AAV储存和稀释注意事项AAV4℃保存（一周内使用完最佳）期保存请分装后放置于-80℃。注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融病毒滴度会降低10%-50%），因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融。汉恒生物已对病毒进行了分装（200l/tube），收到后请直接放置-80℃保存即可。b．若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度。AAV需要稀释病毒时，请将病毒取出冰浴融解，再使用无菌PBS或生理盐水混匀分装后置于4℃保存(一周内使用完最佳)。三、AAV介绍腺相关病毒（AAV）属微小病毒科(parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA病毒。只有在腺病毒或者疱疹病毒等辅助病毒协助下，宿主才能产生具有感染性的AAV，所以AAV被称作腺相关病毒。典型的AAV2基因组约4800bp，包括2个反向末端重复序列(ITR，145bp)和两个读码框(ORF)-Rep和Cap（图1）。ITR对合成互补DNA链是必需的；Rep和Cap可以翻译成多种不同蛋白，如AAV生活周期必需的Rep78、Rep68、Rep52和Rep40以及包膜蛋白VP1、VP2及VP3等。AAV病毒系统就是用目的基因替换掉Rep和Cap，然后与表达Rep和Cap基因的质粒共转，从而产生包含目的基因的AAV。目前AAV有12种血清型、100多种变体。不同的血清型对组织或器官有着不同的亲和性。由于安全性高、免疫原性小、表达周期久等优点，AAV被称为目前最适合在体（invivo）研究基因功能的利器。图1、AAV2基因组结构示意图。四、汉恒生物AAV产品服务及载体信息与现货列表；；常规启动子和组织特异性启动子驱动的AVC9定制；AV（23；双标3（VDO2101312组织特异性-拥有DIO载体名称载体名称可插入片段大小启动子及其特点标记基因是否Cre依赖载体名称载体名称可插入片段大小启动子及其特点标记基因是否Cre依赖过表达pHBAAV-CMV-MCS-T2A-ZsGreen1.6kbCMV，广谱，强ZsGreen否pHBAAV-CMV-MCS-EF1-mcherry1.2kbCMV，广谱，强ZsGreen否pHBAAV-CAG-MCS-T2A-ZsGreen1.5kbCAG，广谱，强ZsGreen否pHBAAV-CAG-MCS-T2A-mcherry1.5kbCAG，广谱，强mcherry否pHBAAV-hsyn-MCS-T2A-ZsGreen1.6kbhSyn，成熟神经元，中强度ZsGreen否pHBAAV-hsyn-MCS-T2A-mCherry1.6kbhSyn，成熟神经元，中强度mcherry否pHBAAV-cTNT-MCS-ZsGreen1.6kbcTNT，心肌细胞，中强度ZsGreen否pHBAAV-TBG-MCS-P2A-mCherry1.6kbTBG，肝实质细胞，中强度mcherry否pHBAAV-CamkII-MCS-T2A-ZsGreen1.6kbCamkII，兴奋性经元神经特异启动子，强ZsGreen否pHBAAV-CamkII-MCS-T2A-mCherry1.6kbCamkII，兴奋性经元神经特异启动mcherry否PAGEPAGE8子，强pHBAAV-GFAP-T2A-EGFP1.6kbGFAP，星形胶质细胞，中强度EGFP否pHBAAV-SM22a-ZsGreen1.8kbSM22a，平滑肌，中强度ZsGreen否pHBAAV-TIE-ZsGreen1.6kbTIE，内皮细胞，中强度ZsGreen否pHBAAV-CD68-ZsGreen1.6kbCD68，小胶质细胞，中强度ZsGreen否pHBAAV-Spc5-12-ZsGreen1.6kbSpc，肺上皮细胞，中强度ZsGreen否pHBAAV-c-fos-ZsGreen1.6kbc-fos，兴奋神经元，中强度ZsGreen否pHBAAV-Rpe65-ZsGreen1.6kbRpe65，视网膜，中强度ZsGreen否pHBAAV-mecp2-ZsGreen1.6kbmecp2，较短的神经元，中强度ZsGreen否pHBAAV-MHCK7-ZsGreen1.6kbMHCK7，肌肉特异，中强度ZsGreen否pHBAAV-hVGAT-ZsGreen1.6kbhVGAT，GABA能神经元ZsGreen否pHBAAV-FABP4-ZsGreen1.6kbFABP4，脂肪细胞ZsGreen否环状RNA过表达pHBAAV-CMV-cir-EF1-ZsGreen1.2kbCMV，广谱，强ZsGreen否DIOpHBAAV-CMV-DIO-MCS-T2A-ZsGreen1.2kbCMV，广谱，强ZsGreen是pHBAAV-CAG-DIO-MCS-T2A-ZsGreen1.2kbCAG，广谱，强ZsGreen是pHBAAV-GFAP-DIO-EGFP1.9kbhSyn，成熟神经元，中强度无否pHBAAV-hSyn-DIO-MCS-mCherry1.2kbhSyn，成熟神经元，中强度mcherry是干扰pHBAAV-U6-MCS-CMV-ZsGreenshRNAU6ZsGreen否pHBAAV-U6-MCS-CMV-mCherryshRNAU6mcherry否在体敲除pHBAAV-U6-gRNA-saCas9gRNAU6无否（2）载体类型载体名称启动子及其特点标记基因是否Cre依赖抑制pHBAAV-CAG-DIO-eNpHR3.0-EYFP人巨细胞病毒启动子EYFP是激活pHBAAV-CAG-DIO-hChR2(H134R)-mcherryCMV和鸡beta-actin嵌合型启动子），广谱，强mcherry是红光激活pHBAAV-CAG-DIO-C1V1(t/t)-TS-mcherrymcherry是抑制pHBAAV-CAG-DIO-Arch3.0-EYFPEYFP是激活pHBAAV-CAG-DIO-hCHETA-EYFPEYFP是抑制pHBAAV-hSyn-eNpHR3.0-EYFPhSyn（人源成熟神经元特异启动子），中强度EYFP否激活pHBAAV-hSyn-hChR2(H134R)-mcherrymcherry否红光激活pHBAAV-hSyn-DIO-C1V1-(t/t)-TS-mcherrymcherry否抑制pHBAAV-hSyn-Arch3.0-EYFPEYFP否激活pHBAAV-hSyn-hCHETA-EYFPEYFP否红光激活pHBAAV-GFAP-DIO-C1V1(t/t)-TS-mcherryGFAP（星形胶质细胞特异启动子），中强度mcherry否抑制pHBAAV-CaMKII-eNpHR3.0-EYFPCaMKII（兴奋性经元神经特异启动子），强EYFP否激活pHBAAV-CaMKII-hChR2(H134R)-mcherrymcherry否红光激活pHBAAV-CaMKII-DIO-C1V1(t/t)-TS-mcherrymcherry否抑制pHBAAV-CaMKII-Arch3.0-EYFPEYFP否激活pHBAAV-CaMKII-hCHETA-EYFPEYFP否红光激活pHBAAV-CaMKII-DIO-C1V1(t/t)-TS-mcherryCMV（人巨细胞病毒启动子），广谱，强mcherry否（3）载体类型载体名称启动子及其特点标记基因是否Cre依赖白喉毒素介导的细胞毒性pHBAAV-CAG-DIO-DTR-mCherryCAG（CMV和鸡beta-actin动子），广谱，强mcherry是pHBAAV-hSyn-DTR-mCherryhSyn（人源成熟神经元特异启动子），中强度mcherry否pHBAAV-CaMKII-DTR-mCherryCaMKII（兴奋性经元神经特异启动子），强mcherry否CAG（CMVGq-DREADDpHBAAV-CAG-DIO-hM3D(Gq)-mCherry和鸡beta-actin嵌合型启动子），广mCherry是谱，强CAG（CMVGi-DREADDpHBAAV-CAG-DIO-hM4D(Gi)-mCherry和鸡beta-actin嵌合型启动子），广mCherry是谱，强hSyn（人源成Gq-DREADDpHBAAV-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry熟神经元特异启动子），中mCherry否强度hSyn（人源成Gq-DREADDpHBAAV-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry熟神经元特异启动子），中mCherry是强度hSyn（人源成Gi-DREADDpHBAAV-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry熟神经元特异启动子），中mCherry是强度hSyn（人源成Gi-DREADDpHBAAV-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry熟神经元特异启动子），中mCherry否强度Gq-DREADDpHBAAV-GFAP-hM3D(Gq)-mCherryGFAP（星形胶质细胞特异启动子），强mCherry否Gi-DREADDpHBAAV-GFAP-hM4D(Gi)-mCherryGFAP（星形胶质细胞特异启动子），强mCherry否Gq-DREADDpHBAAV-CaMKII-hM3D(Gq)-mCherryCaMKII（兴奋性经元神经特异启动子），强mCherry否Gq-DREADDpHBAAV-CaMKII-DIO-hM3D(Gq)-mCherryCaMKII（兴奋性经元神经特异启动子），强mCherry是Gi-DREADDpHBAAV-CaMKII-hM4D(Gi)-mCherryCaMKII（兴奋性经元神经特异启动子），强mCherry否AAV-mRFP-GFP-LC3（4）载体类型载体名称启动子及其特点标记基因是否Cre依赖双标pHBAAV-mRFP-GFP-LC3CMV，广谱，强mRFP/GFP否PAGEPAGE14五、整体包装流程（图2）图2、AAV包装实验流程图。六、实验材料AAV系统包括目的基因表达质粒（过表达、干扰等）pHBAAV-xxx（表1~4）、包装载体pAAV-RC和pHelper。1~4Stbl3DMEM+10%FBS完AAV-293注：为了达到最好的细胞培养状态，推荐使用汉恒生物推出的SaveItTM抗支原体试剂（货号：HB-SV-1/2/3/5/10）。七、AAV载体构建AAVpHBAAV-xxx1AAV（23）（Qiagen、MN1g/l，A260/280注：为了快速高效构建载体，强烈推荐使用汉恒生物推出的HB-InfusionTM无缝克隆载体构建试剂盒（货号：HB-infusion-20/50/100）。八、AAV包装pAAV-RC10μgpAAV-RC10μgpHelper20μgpHBAAV-xxx10μgLipoFiterTM100l表5、AAV包装过程中转染一个标准10cmdish所需要质粒和转染试剂用量表。DMEM37LipoFiterTM6h注：1、LipoFiterTMLipoFiterTM说明书（货号：HB-TRLF-1/2/3/10）。2、转染前细胞必须处于良好的生长状态。3、病毒实验带有一定的危作。九、AAV收集和纯化转染后72h，收集所有的细胞用液氮反复冻融三次收集上清液，然后使用Benonase酶消化，所得上清用Biomiga品牌纯化柱纯化，所得病毒分装后于-80°C保存。十、AAV滴度测定t表6：样品名称CT值1CT值2CT值31010标准品4.514.324.42109标准品7.217.617.25108标准品10.9710.5510.67107标准品14.1914.3814.35106标准品17.7517.5817.68待测AAV样品12.7812.6512.81表6、一次典型绝对定量过程中标准品和待测样品的CT值。Ct(averageYX，绘图3图3、绝对定量中的标准曲线。把待测样品的CtX=75V0x00v.g./ml=107.4540000=1.11012十一、 感细测试感染293TCHO（，通常MOI104~105之间(MOI注：AAV对细胞系的感染能力很弱，一般不推荐用于体外实验。十二、AAV用于动物实验纯化后的（注射感染组织器官至少3如,RFP等）（可以组化染色PC（qPCR（W来考察基因表达（一般情况下，对于心肌、骨骼肌、肝脏、肾脏、皮肤等适合原位注射的组织器官，如果GFP3~4）汉恒生物整理了常用组织器官的感染条件和效果图谱供大家参阅：PAGEPAGE15PAGEPAGE21十三、 案例享AAV介导CRISPR-Cas9基因组编辑系统矫正小鼠肝脏尿素代谢异常（Ornithinetranscarbamylase,OTC）CRISPR-Cas9基因组编辑技术对缺陷（）（Humanthyroxine-bindingglobulinpromoterTBGpromoter，TBG）saCas9(TBG-saCas9sgRNA（U6-sgACoorae（b（c3疫荧光实验表明10（d作为工具传递saCas9sgRNA复模板。由于4.8kb，所以研究者设计了双载体系统，即saCas9sgRNA结合肝脏特异的启动子TBGsaCas9参考AVV大提高了基因编辑的组织特异性，这为将来的临床应用奠定了坚实的基础。附件1：DIO原理DIO全称是Double-floxedInvertedOrientation，是依赖于Cre-LoxP重组原理设计的组织特异性基因表达系统。原理如下图所示：目的基因两侧分别带有两对正交的LxP位点（如图的紫色LxP和绿色的x2722CreCreCre情况下，目的基因的表达框（eYFPChR2）会颠倒（inverted）一次，从而使目的基Cre表达，目的基因不会逆转，所以不会成功地翻译出蛋白。因此，DIOCre(1,2)(3-13)附件2：实验室病毒操作应急预案一、针对病毒（慢病毒、腺病毒、腺相关病毒及逆转录病毒）溢出1、戴一次性乳胶手套及实验用口罩，穿实验服，必要时需进行脸和眼睛防护，在生物安全柜中操作病毒实验。2周围区域（通常可以使用84消毒液。3、使用消毒剂时，从溢出区域的外围开始，朝向中心进行处理。作用适当时间后（例如30in，将所处理物质清理掉。4、如果含有碎玻璃或其他锐器，则要使用镊子、簸箕或硬的厚纸板来收集处理过的物品，并将它们置于可防刺透的容器中以待处理。切勿直接用手进行操作。5、对溢出区域再次清洁并消毒（2～4穿透的废弃物处理容器中。二、病毒液体接触到皮肤或眼睛175%乙醇消毒液（0.2-0.5%酸、500-10000mg/L）84分钟。2、如果遇到针头扎伤或者刀片割伤时，第一时间处理伤口，应立即用力捏住受伤部位，向离心方向挤出伤口的血液，不可来回挤压，同时用流动水清洗伤口，至少15分钟。3、若感染性物质意外进入眼睛、口腔，立即用大量流动清水或生理盐水冲洗，至少15分钟。4、病毒污染眼部或眼睛周围：立刻用洗眼器或洗眼液冲洗眼部，至少15分钟，并到医院开具抗病毒眼药水。5、经简单处理或消毒后，务必立即前往急诊室就诊。保留完整适宜的医疗记录。6、意外受伤或感染后必须在24小时内报告实验室管理人员，并填写生物安全事件报告书。三、病毒溢出污染离心机1、遇病毒溢出污染离心机，应立刻停止离心，离开实验室，开启实验室紫外灯60分钟。离心机一个小时后打开，让病原物质沉降一下，然后工作人员戴双重口罩或N95口罩，用镊子和酒精擦拭污染部位。2、处理完毕后，脱弃外层手套，再开紫外照射60分钟。填写意外事故登记表。部分参考文献（汉恒AAV产品）FengB,Letal.Pre-ischemiamelatonintreatmentalleviatedacuteneuronalinjuryafterischemicbyinhibitingERstress-dependentautophagyviaPERKandIRE1signalings.JPineal2017.(客户文章:自噬双标LandeggerLetal.(2017)NatureBiotechnologyChen,M.,etal.(2017)."EfficientGeneDeliveryandExpressioninPancreasandPancreaticbyCapsid-OptimizedVectors."HumGeneTherMethods28(1):49-59.（）H,XiWetal.Laterodorsaltegmentuminterneuronsubtypesoppositelyregulateolfactorycue-inducedinnateNatNeurosci201619:283-289WuX,WuX,MaYetal.CUG-bindingprotein1regulatesHSCactivationandliverfibrogenesis.NatCommun2016;7:13498.（）Wei,etal.(2016).“PreventionofMuscleWastingbyCRISPR/Cas9-mediatedDisruptionofMyostatinInVivo.”MolecularTherapy24(11):1889-1891.（汉恒合作发表论文：AAV-saCas9编辑肌肉细胞）Deverman,B.E.,etal.(2016)."Cre-dependentselectionyieldsvariantsforwidespreadgenetransfertotheadultbrain."NatureBiotechnology34(2)204-209.（）etal.(2016)AdualsystemenablestheCas9-mediatedcorrectionofametabolicliverdiseaseinnewbornmiceNatureBiotechnology34(3)334-338