自由基损伤学说及抗氧化剂课件

铁器在空气中暴露日久会生锈，洁白的银器也会由于氧化变黑。人的机体与金属一样也会受到氧化而导致“生锈”，罪魁就是自由基。1铁器在空气中暴露日久会生锈，洁白的银器也会由于

1956年英国分子生物学家Harman首次提出：

“氧化应激决定寿命”，即自由基衰老学说，认为衰老是自由基引起的组织随机毒害的结果。

Harman,D.J.Gerontol.1956;11:298-300

氧化应激是由于氧自由基过量生成和(或)细胞内抗氧化防御系统受损,导致氧自由基及其相关代谢产物过量聚集,从而对细胞产生多种毒性作用的病理状态。21956年英国分子生物学家Harman首次提出：生成增加，消除减少PhysiolRev.2019;82:47–95.3生成增加，消除减少PhysiolRev.2019;823FreeRadicalBiology&Medicine

(IF=5.423)FreeRadicalRes

(IF=2.878)AntioxidRedoxSignal

(IF=8.456)RedoxReport

(IF=1.732)Journalsofimpactfactor4Journalsofimpactfactor4ImpactFactorDistributionsIF>10.0=102journals(1.6%) EliteIF>5.0=228journals(3.6%) ExcellentIF>3.0=597journals(9.3%) VeryGoodIF>2.0=869journals(13.5%) GoodIF>1.0=2,020journals(31.5%) FairIF<1.0=2,601journals(40.5%) PoorFromatotalof6,417SCIindexedjournalsasofMarch,20195ImpactFactorDistributionsIF>自由基的概念6自由基的概念6自由基（Freeradicals）是指外层电子轨道带有一个或多个未成对电子的分子、原子、离子或者基团。7自由基（Freeradicals）7活性氧（ROS）

是指分子氧在还原过程中的一系列中间产物。活性氧包括以自由基形式存在和不以自由基形式存在的具有高活性的中间产物。O2·-H2O2OH·SODCat活性氧自由基活性氧自由基GPX8活性氧（ROS）O2·-H2O2常见自由基的

理化性质9常见自由基的

理化性质9常见自由基活性氧

（ReactiveOxygenSpecies,ROS）活性氮（ReactiveNitrogenSpecies，RNS）

以碳、氧、氮或硫原子为中心的自由基

10常见自由基活性氧以碳、氧、氮或硫原子为中心的自由基10

活性氧（ROS）O2·-H2O2OH·SODCatNO.+O2·-

→ONOO-活性氮（RNS）过氧亚硝基阴离子11活性氧（ROS）O2·-H超氧阴离子

(O2·-)化学性质：O2·-在细胞内可直接导致DNA损伤，并可使过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和肌酸激酶失活，其细胞毒性作用主要通过衍生产生H2O2和OH·。清除：细胞内有SOD起清除作用。12超氧阴离子(O2·-)化学性质：O2·-在细胞内可直接导致过氧化氢

(H2O2)化学性质：H2O2的性质较稳定，半衰期最长，可以穿透大部分细胞膜，因而可以发挥重要的信使功能，但这一特性也增加了其细胞毒作用。清除：H2O2在体内可经过氧化氢酶作用降解为水和氧气。“长效”“稳定”13过氧化氢(H2O2)化学性质：H2O2的性质较稳定，半衰期羟自由基

(OH·)化学性质：OH·是已知活性最强的氧化剂，化学性质极为活泼，几乎可以与所有细胞成分发生反应，对机体危害极大。但是由于其作用范围小，仅能与它的邻近的分子反应。清除：主要通过抗坏血酸、GSH（或其他的硫醇）、褪黑色素、NADPH等活性物质及细胞色素P450体系降解和清除。“寿命短”“稳定差”14羟自由基(OH·)化学性质：OH·是已知活性最强的氧化剂，过氧亚硝基阴离子（ONOO-）化学性质：ONOO-作为一种强氧化剂，可以介导蛋白巯基和非蛋白巯基的氧化，并可氧化细胞膜脂、蛋白及DNA，导致细胞损伤和疾病的发生或介导信号转导。降解：在碱性条件下，ONOO-比较稳定。一旦质子化，立即分解产生类羟基和NO2自由基。15过氧亚硝基阴离子（ONOO-）化学性质：ONOO-作为一种强1616机体对自由基的防御17机体对自由基的防御171818氧化应激与心血管疾病19氧化应激与心血管疾病19在生理情况下活性氧可维持在极低水平，参与机体生长发育的调控，信号转导、诱导增殖与分化、诱导凋亡，调节运动等多种生理过程，在生物体内发挥着重要的功能。生成增加，消除减少机体损伤20在生理情况下活性氧可维持在极低水平，参与机体生长发动脉粥样硬化是动脉硬化性血管病中最常见的一种。动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样。引起管壁增厚变硬、失去弹性和管腔缩小。21动脉粥样硬化是动脉硬化性血管病中最常见的一种。21222222氧化应激与动脉粥样硬化ATVB.2019;25:29-38.23氧化应激与动脉粥样硬化ATVB.2019;25:29-38AT1ReceptorAngIIThrombinPDGFTNF-αNADPHOxidaseAcitvityO2.-NADPH氧化酶与动脉粥样硬化AT1ReceptorAntagnoistLackofp47phox24AT1ReceptorAngIIThrombinPDGFT氧化应激与高血压25氧化应激与高血压25自由基的信号转导途径26自由基的信号转导途径26氧自由基参与信号转导通路

EGFReceptorProteinTyrosinePhosphatasesInsulinReceptorKinaseActivityCytoplasmicProteinKinasesMAPKCascadesProteinKinaseCIsoformsCytosolicCa2+ConcentrationsTranscriptionFactor27氧自由基参与信号转导通路EGFReceptor27RoleofROSinEGFReceptor-MediatedSignalling28RoleofROSinEGFReceptor-Me

MAPK信号级联反应StimulusGrowthfactors,Mitogen,GPCRp38MAPKStress,GPCR,Inflammatorycytokines,GrowthfactorsStress,Growthfactors,Mitogen,GPCRMEKK1,4,MLK3,ASK1MEKK2,3,Tpl2MLK3,TAK,DLKRaf,Mos,Tpl2MKK3/6MEK1/2MKK4/7MEK5ERK1/2MAPKKKGrowth,Differentiation,DevelopmentInflammation,Apoptosis,Growth,DifferentiationGrowth,Differentiation,DevelopmentERK5/BMK1JNK1,2,3MAPKKMAPKBiologicalresponses

MAPK信号级联反应StimulusGrowthfact29自由基的检测30自由基的检测30化学发光法检测原理：活性氧、氧自由基与发光增效剂反应，释放能量，产生化学发光。检测对象：超氧阴离子、羟自由基、H2O2

和脂质过氧化产生的自由基都可以产生化学发光。优点：灵敏、快速、操作简单、价格低廉。缺点：非特异性。另外，几乎所有的氧化剂，如次氯酸、高锰酸钾等都可以与发光增效剂反应，产生化学发光，严重干扰活性氧的检测。Fe2+也可以产生非常强的化学发光。31化学发光法检测原理：活性氧、氧自由基与发光增效剂反应，释放能二氢乙啶(Dihydroethidium,DHE)

检测原理：可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的超氧阴离子氧化，形成氧化乙啶；氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种快速简便的组织或培养活细胞中ROS经典检测方法。32二氢乙啶(Dihydroethidium,DHE)检测原Circulation.2019;117:1045-1054.DeterminationofROSbyDHEStaining33Circulation.2019;117:1045-105检测原理：在碱性条件下，光泽精与超氧阴离子等过氧化物作用形成激发态N2甲基吖啶(N2methylacridan)。并发出450nm的激发光，测量此激发光的强度即可定量产生的超氧阴离子的浓度。可以定量，但检测时间长，并需要新鲜组织样本。Lucigenin(光泽精)-EnhancedChemiluminescence34检测原理：在碱性条件下，光泽精与超氧阴离子等过氧化物作用形成DeterminationofROSbyLucigenin-EnhancedChemiluminescence35DeterminationofROSbyLucige检测原理：DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，检测DCF的荧光就可以得到细胞内活性氧的水平。2’,7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)36检测原理：DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进BrJPharmacol.2019;154(1):105-13.DeterminationofROSby

DCFH-DAStaining37BrJPharmacol.2019;154(1):10383838393939404040自由基损伤学说及抗氧化剂课件41影响自由基的药物42影响自由基的药物42影响自由基的药物抗氧化药物促氧化药物“以毒攻毒”43影响自由基的药物抗氧化药物43抗氧化药物①维生素类及内源性物质，如维生素E、维生素C、维生素A、GSH等；②活性氧防御酶类，如SOD、过氧化氢酶、过氧化物酶、Co-Q类等；③化合物，如SOD模拟化合物、普罗布考以及一些传统药物如硫酸锌、甘露醇、钙拮抗药、血管紧张素转化酶抑制药、肼肽嗪、乙酰半胱氨酸、β2受体激动药及阻断药等；④中药及其有效成分，如银杏、丹参、云芝及其所含的黄酮类、酚类、多糖类等.44抗氧化药物①维生素类及内源性物质，如维生素E、维生素C、维4545①化学性直接产生自由基及活性氧；②通过作用于机体防御机制，促进机体内自由基、活性氧产生。巨噬细胞、中性粒细胞在对侵入机体的抗原通过吞噬作用而进行消化分解的同时，产生超氧化物、过氧化物以破坏抗原。促氧化药物46①化学性直接产生自由基及活性氧；促氧化药物46莫特沙芬进入机体后可选择性定位并在癌细胞中蓄积，破坏细胞代谢，产生ROS并促使细胞凋亡。临床前研究显示莫特沙芬可加强放疗及几种常用化疗药的疗效。促氧化药物47莫特沙芬进入机体后可选择性定位并在癌细胞中蓄积，破坏细胞代谢谢谢！谢谢！48自由基损伤学说及抗氧化剂课件49

铁器在空气中暴露日久会生锈，洁白的银器也会由于氧化变黑。人的机体与金属一样也会受到氧化而导致“生锈”，罪魁就是自由基。50铁器在空气中暴露日久会生锈，洁白的银器也会由于

1956年英国分子生物学家Harman首次提出：

“氧化应激决定寿命”，即自由基衰老学说，认为衰老是自由基引起的组织随机毒害的结果。

Harman,D.J.Gerontol.1956;11:298-300

氧化应激是由于氧自由基过量生成和(或)细胞内抗氧化防御系统受损,导致氧自由基及其相关代谢产物过量聚集,从而对细胞产生多种毒性作用的病理状态。511956年英国分子生物学家Harman首次提出：生成增加，消除减少PhysiolRev.2019;82:47–95.52生成增加，消除减少PhysiolRev.2019;8252FreeRadicalBiology&Medicine

(IF=5.423)FreeRadicalRes

(IF=2.878)AntioxidRedoxSignal

(IF=8.456)RedoxReport

(IF=1.732)Journalsofimpactfactor53Journalsofimpactfactor4ImpactFactorDistributionsIF>10.0=102journals(1.6%) EliteIF>5.0=228journals(3.6%) ExcellentIF>3.0=597journals(9.3%) VeryGoodIF>2.0=869journals(13.5%) GoodIF>1.0=2,020journals(31.5%) FairIF<1.0=2,601journals(40.5%) PoorFromatotalof6,417SCIindexedjournalsasofMarch,201954ImpactFactorDistributionsIF>自由基的概念55自由基的概念6自由基（Freeradicals）是指外层电子轨道带有一个或多个未成对电子的分子、原子、离子或者基团。56自由基（Freeradicals）7活性氧（ROS）

是指分子氧在还原过程中的一系列中间产物。活性氧包括以自由基形式存在和不以自由基形式存在的具有高活性的中间产物。O2·-H2O2OH·SODCat活性氧自由基活性氧自由基GPX57活性氧（ROS）O2·-H2O2常见自由基的

理化性质58常见自由基的

理化性质9常见自由基活性氧

（ReactiveOxygenSpecies,ROS）活性氮（ReactiveNitrogenSpecies，RNS）

以碳、氧、氮或硫原子为中心的自由基

59常见自由基活性氧以碳、氧、氮或硫原子为中心的自由基10

活性氧（ROS）O2·-H2O2OH·SODCatNO.+O2·-

→ONOO-活性氮（RNS）过氧亚硝基阴离子60活性氧（ROS）O2·-H超氧阴离子

(O2·-)化学性质：O2·-在细胞内可直接导致DNA损伤，并可使过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和肌酸激酶失活，其细胞毒性作用主要通过衍生产生H2O2和OH·。清除：细胞内有SOD起清除作用。61超氧阴离子(O2·-)化学性质：O2·-在细胞内可直接导致过氧化氢

(H2O2)化学性质：H2O2的性质较稳定，半衰期最长，可以穿透大部分细胞膜，因而可以发挥重要的信使功能，但这一特性也增加了其细胞毒作用。清除：H2O2在体内可经过氧化氢酶作用降解为水和氧气。“长效”“稳定”62过氧化氢(H2O2)化学性质：H2O2的性质较稳定，半衰期羟自由基

(OH·)化学性质：OH·是已知活性最强的氧化剂，化学性质极为活泼，几乎可以与所有细胞成分发生反应，对机体危害极大。但是由于其作用范围小，仅能与它的邻近的分子反应。清除：主要通过抗坏血酸、GSH（或其他的硫醇）、褪黑色素、NADPH等活性物质及细胞色素P450体系降解和清除。“寿命短”“稳定差”63羟自由基(OH·)化学性质：OH·是已知活性最强的氧化剂，过氧亚硝基阴离子（ONOO-）化学性质：ONOO-作为一种强氧化剂，可以介导蛋白巯基和非蛋白巯基的氧化，并可氧化细胞膜脂、蛋白及DNA，导致细胞损伤和疾病的发生或介导信号转导。降解：在碱性条件下，ONOO-比较稳定。一旦质子化，立即分解产生类羟基和NO2自由基。64过氧亚硝基阴离子（ONOO-）化学性质：ONOO-作为一种强6516机体对自由基的防御66机体对自由基的防御176718氧化应激与心血管疾病68氧化应激与心血管疾病19在生理情况下活性氧可维持在极低水平，参与机体生长发育的调控，信号转导、诱导增殖与分化、诱导凋亡，调节运动等多种生理过程，在生物体内发挥着重要的功能。生成增加，消除减少机体损伤69在生理情况下活性氧可维持在极低水平，参与机体生长发动脉粥样硬化是动脉硬化性血管病中最常见的一种。动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样。引起管壁增厚变硬、失去弹性和管腔缩小。70动脉粥样硬化是动脉硬化性血管病中最常见的一种。21712271氧化应激与动脉粥样硬化ATVB.2019;25:29-38.72氧化应激与动脉粥样硬化ATVB.2019;25:29-38AT1ReceptorAngIIThrombinPDGFTNF-αNADPHOxidaseAcitvityO2.-NADPH氧化酶与动脉粥样硬化AT1ReceptorAntagnoistLackofp47phox73AT1ReceptorAngIIThrombinPDGFT氧化应激与高血压74氧化应激与高血压25自由基的信号转导途径75自由基的信号转导途径26氧自由基参与信号转导通路

EGFReceptorProteinTyrosinePhosphatasesInsulinReceptorKinaseActivityCytoplasmicProteinKinasesMAPKCascadesProteinKinaseCIsoformsCytosolicCa2+ConcentrationsTranscriptionFactor76氧自由基参与信号转导通路EGFReceptor27RoleofROSinEGFReceptor-MediatedSignalling77RoleofROSinEGFReceptor-Me

MAPK信号级联反应StimulusGrowthfactors,Mitogen,GPCRp38MAPKStress,GPCR,Inflammatorycytokines,GrowthfactorsStress,Growthfactors,Mitogen,GPCRMEKK1,4,MLK3,ASK1MEKK2,3,Tpl2MLK3,TAK,DLKRaf,Mos,Tpl2MKK3/6MEK1/2MKK4/7MEK5ERK1/2MAPKKKGrowth,Differentiation,DevelopmentInflammation,Apoptosis,Growth,DifferentiationGrowth,Differentiation,DevelopmentERK5/BMK1JNK1,2,3MAPKKMAPKBiologicalresponses

MAPK信号级联反应StimulusGrowthfact78自由基的检测79自由基的检测30化学发光法检测原理：活性氧、氧自由基与发光增效剂反应，释放能量，产生化学发光。检测对象：超氧阴离子、羟自由基、H2O2

和脂质过氧化产生的自由基都可以产生化学发光。优点：灵敏、快速、操作简单、价格低廉。缺点：非特异性。另外，几乎所有的氧化剂，如次氯酸、高锰酸钾等都可以与发光增效剂反应，产生化学发光，严重干扰活性氧的检测。Fe2+也可以产生非常强的化学发光。80化学发光法检测原理：活性氧、氧自由基与发光增效剂反应，释放能二氢乙啶(Dihydroethidium,DHE)

检测原理：可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的超氧阴离子氧化，形成氧化乙啶；氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种快速简便的组织或培养活细胞中ROS经典检测方法。81二氢乙啶(Dihydroethidium,DHE)检测原Circulation.2019;117:1045-1054.DeterminationofROSbyDHEStaining82Circulation.2019;117:1045-105检测原理：在碱性条件下，光泽精与超氧阴离子等过氧化物作用形成激发态N2甲基吖啶(N2methylacridan)。并发出450nm的激发光，测量此激发光的强度即可定量产生的超氧阴离子的浓度。可以定量，但检测时间长，并需要新鲜组织样本。Lucigenin(光泽精)-EnhancedChemiluminescence