培养基制备及无菌操作课件

培养基制备及无菌操作员工培训2012-8-21微生物的营养及类型微生物的营养物质营养物（nutrient）：那些能够满足机体生长、繁殖和完成各种生理活动所需要的物质通常称为微生物的营养物质。微生物的营养物质按其在机体中的生理作用可区分为：碳源、氮源、无机盐、生长因子和水五大类。营养（或叫营养作用，nutrition）：微生物获得与利用营养物质的过程通常称为营养。1.碳源类型元素水平化合物水平培养基原料水平有机碳C·H·O·N·X复杂蛋白质、核酸等牛肉膏、蛋白胨、花生饼粉等C·H·O·N多数氨基酸、简单蛋白质等一般氨基酸、明胶等C·H·O糖、有机酸、醇、脂类等葡萄糖、蔗糖、各种淀粉、糖蜜等C·H烃类天然气、石油及其不同馏份、石蜡油等无机碳C(?)——C·OCO2CO2C·O·XNaHCO3NaHCO3、CaCO3、白垩等表4-4微生物的碳源谱1.碳源

洋葱假单胞菌唯一碳源的化合物有:碳水化合物及其衍生物：19种脂肪酸：11种二羧酸：9种其它有机酸：12种伯醇：3种氨基酸：12种其它氮化合物：13种无氮环状化合物：9种微生物不同，利用上述含碳化合物的能力不同，如假单胞菌属中的某些种可以利用90种以上的不同类型的碳源物质；而某些甲基营养型细菌只能利用甲醇或甲烷等一碳化合物进行生长。2.氮源

氮源(nitrogensource)凡是提供微生物营养所需的氮元素的营养源，称为氮源。氮源物质的主要作用是合成细胞物质中含氮物质，少数自养细菌能利用铵盐、硝酸盐作为机体生长的氮源与能源，某些厌氧细菌在厌氧与糖类物质缺乏的条件下，也可以利用氨基酸作为能源物质。表4-5微生物的氮源谱2.氮源类型元素水平化合物水平培养基原料水平有机氮N·C·H·O·X复杂蛋白质、核酸等牛肉膏、酵母膏、饼粕粉、蚕蛹粉等N·C·H·O尿素、一般氨基酸、简单蛋白质等尿素、蛋白胨、明胶等无机氮N·HNH3、铵盐等(NH4)2SO4等N·O硝酸盐等KNO3等NN2空气氮源的利用顺序:N·C·H·O或N·C·H·O·X>N·H>N·O>N3.能源能为微生物生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能，称为能源。

有机物：化能异养微生物的能源（同碳源）

化学物质

无机物：化能自养微生物的能源（不同于碳源）能源谱

辐射能：光能自养和光能异养微生物的能源4.无机盐元素化合物形式生理功能磷KH2PO4K2HPO4核酸、核蛋白、磷脂、辅酶及ATP等高能分子的成分，作为缓冲系统调节培养基pH硫(NH4)2SO4MgSO4含硫氨基酸(半胱氨酸、甲硫氨酸等)、维生素的成分，谷胱甘肽可调节胞内氧化还原电位镁MgSO4己糖磷酸化酶、异柠檬酸脱氢酶、核酸聚合酶等活性中心组分，叶绿素和细菌叶绿素成分钙CaCl2Ca(NO3)2某些酶的辅因子，维持酶(如蛋白酶)的稳定性，芽孢和某些孢子形成所需，建立细菌感受态所需钠NaCl细胞运输系统组分，维持细胞渗透压，维持某些酶的稳定性钾KH2PO4K2HPO4某些酶的辅因子，维持细胞渗透压，某些嗜盐细菌核糖体的稳定因子铁FeSO4细胞色素及某些酶的组分，某些铁细菌的能源物质，合成叶绿素、白喉毒素所需6.水水是微生物生长所必不可少的。水在细胞中的生理功能主要有：①起到溶剂与运输介质的作用（营养物质的吸收与代谢产物的分泌必须以水为介质才能完成）；②参与细胞内一系列化学反应；③维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然构象；④因为水的比热高，是热的良好导体，能有效地吸收代谢过程中产生的热并及时地将热迅速散发出体外，从而有效地控制细胞内温度的变化；⑤保持充足的水分是细胞维持自身正常形态的重要因素；⑥微生物通过水合作用与脱水作用控制由多亚基组成的结构，如酶、微管、鞭毛及病毒颗粒的组装与解离。微生物营养类型微生物种类繁多，其营养类型比较复杂，根据碳源、能源及电子供体性质的不同，可将绝大部分微生物分成不同营养类型划分依据营养类型特点碳源自养型以CO2为唯一或主要碳源异养型以有机物为碳源能源光能营养型以光为能源化能营养型以有机物氧化释放的化学能为能源电子供体无机营养型以还原性无机物为电子供体有机营养型以有机物为电子供体微生物营养类型营养类型电子供体碳源能源举例光能无机自养型H2、H2S、S、或H2OCO2光能蓝细菌、藻类光能有机异养型有机物有机物光能红螺细菌化能无机自养型H2、H2S、Fe2+、NH3、或NO2-CO2化学能氢细菌、硫杆菌、亚硝化单胞菌属化能有机异养型有机物有机物化学能假单胞菌属、真菌、营养物质的运输方式营养物质能否被微生物利用的一个决定性因素是这些营养物质能否进入微生物细胞。只有营养物质进入细胞后才能被微生物细胞内的新陈代谢系统分解利用，进而使微生物正常生长繁殖。根据物质运输过程的特点，可将物质的运输方式分为扩散、促进扩散、主动运输与基团转位。营养物质的运输方式比较项目单纯扩散促进扩散主动运输基团转位特异载体蛋白运输速度物质运输方向胞内外浓度运输分子能量消耗运输后物质的结构载体饱和效应与溶质类似物运送抑制剂运送对象举例无慢由浓至稀相等无特异性不需要不变无无竞争性无H2O、CO2、O2、甘油、乙醇、盐类有快由浓至稀相等特异性不需要不变有有竞争性有SO42-、PO43-、糖有快由稀至浓胞内浓度高特异性需要不变有有竞争性有氨基酸、乳糖等糖类，Na+、Ca2+等无机粒子有快由稀至浓胞内浓度高特异性需要改变有有竞争性有葡萄糖、果糖、甘露糖、嘌呤、核苷、脂肪酸培养基及其类型无论是以微生物为材料的研究，还是利用微生物生产生物制品，都必须进行培养基的配制，它是微生物学研究和微生物发酵生产的基础。培养基是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。培养基及其类型划分标准培养基种类特点用途物理性质液体培养基不加凝固剂工业生产半固体培养基加凝固剂，如琼脂观察微生物的运动、分类鉴定固体培养基微生物的分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种化学成分天然培养基含化学成分不明确的天然物质工业生产合成培养基培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成)分类、鉴别用途选择培养基允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长培养、分离出特定微生物，如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度食盐鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物，如用伊红—美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽)培养基的配制原则培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好，营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需，浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用，例如高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而起到抑菌或杀菌作用。营养协调碳氮比（C/N）直接影响微生物生长与繁殖及代谢物的形成与积累，故常作为考察培养基组成时的一个重要指标；速效性氮（或碳）源与迟效性氮（或碳）源的比例各种金属离子间的比例培养基的配制原则（1）控制pH条件培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。

细菌：7.0~8.0 放线菌：7.5~8.5 酵母菌：3.8~6.0 霉菌：4.0~5.8在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，培养基的初始pH值会发生改变，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式：内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。外源调节：按实际需要不断向发酵液流加酸或碱液理化适宜微生物对水的需要程度（水对微生物生长的影响）常用环境（或基质）中的水活度值（wateractivity,w）表示。所谓w就是水的有效浓度。定义：水活度为在一定的温度条件下，溶液的蒸汽压（材料上部蒸气相中水浓度）与纯水的蒸汽压（即纯水上部蒸气相中水浓度）之比，即：w=/o表示溶液的蒸汽压o表示纯水的蒸汽压在w为0.60~0.99的环境条件均有微生物生长，但对某种微生物而言，它对w的要求是一定的，微生物对水的需求有相当的变化程度。即微生物不同，其生长的最适w亦不同。（3）水活度培养基的配制原则培养基的配制原则微生物w一般细菌0.91酵母菌0.88霉菌0.80噬盐细菌0.70噬盐真菌0.65嗜高渗酵母0.60几类微生物生长最适w培养基的配制原则在配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成分，特别是在发酵工业中，培养基用量很大，利用低成本的原料更体现出其经济价值。配制培养基时，应尽量考虑利用价廉并且易于获得的原料作为培养基的成分，特别是在工业发酵中，培养基用量很大，更应该考虑到这一点，以便降低产品成本。1.以粗代精2.以野代家3.以废代好4.以简代繁5.以氮代朊6.以纤代糖7.以烃代粮8.以国代进经济节约培养基的制备调pH值培养基的制备灭菌培养基的制备倒平板1234待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯附近倒平板。无菌操作及微生物的培养无菌操作无菌操作培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上的过程1.防止试验操作中人为污染样品2.保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。

无菌操作无菌操作的基本要求1.实验室清洁、卫生，实验台面光滑、水平2.先75%酒精消毒，后紫外照射15~30min3.接种细菌时必须穿工作服、带工作帽4.接种所用器具必须经消毒灭菌5.吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸6.接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作1.平板划线法1.平板划线法1.平板划线法2.稀释涂布平板法1.将分别盛有9mL水的6支试管灭菌，并按101~106的顺序编号。2.稀释涂布平板法2.用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。2.稀释涂布平板法3.从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复第2步的操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。3.其他无菌操作三点接种把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。（多用于研究霉菌形态）穿刺接种用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。（用于在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力）3.其他无菌操作3.其他无菌操作浇混接种将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45℃左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养